范常龍，孔繁慧，辛瑞敏，紀(jì)濱英

(哈爾濱市胸科醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150056)

我國目前耐多藥結(jié)核的發(fā)病率為8.32%。結(jié)核病疫情回升主要原因有流動(dòng)人口的增加、診斷治療的延誤、抗結(jié)核藥物的不規(guī)范治療，病人體內(nèi)的結(jié)核菌發(fā)生基因突變對(duì)多種抗結(jié)核藥物發(fā)生耐受性。耐多藥結(jié)核病(MDR－TB)病例增加，治療越來越困難?；颊弑仨毷褂枚€甚至三線藥物治療，這些藥物的毒副作用大、價(jià)格昂貴、療程長而療效低。病人長期痰菌陽性必將增大傳染概率，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致原發(fā)耐藥結(jié)核病大量增加，治療更困難。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象:入選患者是2012年2月至2013年3月在我院住院的結(jié)核患者兩組各60例，統(tǒng)計(jì)耐藥肺結(jié)核疾病患者應(yīng)用耐藥突變基因檢測藥敏結(jié)果。肺結(jié)核診斷主要是根據(jù)臨床癥狀、痰檢及影像檢查并參照肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)排除其他疾病后確診［1］。

1.2 主要試劑和儀器:結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒是亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn)提供;痰快速培養(yǎng)(BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng))美國Becton Dickinson Microbiology Systems生產(chǎn);細(xì)胞培養(yǎng)箱;HR40－ⅡA2型生物安全柜。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測:收集臨床痰樣，加入等量的化痰試劑(4%的NaOH)，充分振蕩化痰處理15～30 min，直至痰液完全液化。轉(zhuǎn)移1.2 mL痰樣消化液到1.5 mL離心管中，12000轉(zhuǎn)/min，離心5 min，棄上清。臨床分離培養(yǎng)的菌株:轉(zhuǎn)移1.2 mL樣本到1.5 mL離心管中，12000轉(zhuǎn)/min，離心5 min，棄上清，收集沉淀。按照上述方法繼續(xù)收集沉淀，直到滿足所需的量。

加入1 mL MTB洗液，充分混勻，12000轉(zhuǎn)/min，離心2 min，棄上清;加入50 μL MTB裂解液，充分混勻，于沸水中煮10 min。12000轉(zhuǎn)/min，離心2 min，上清液即可作為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

雜交、洗膜和顯色:PCR產(chǎn)物在沸水中加熱變性10 min;59℃雜交1.5 h。取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50 mL管中，于59℃輕搖洗滌15 min。POD溶液孵育30 min;用A1室溫洗兩次，5 min/次;顯色液中避光顯色5～10 min。

1.3.2 其他檢測方法:痰改良羅氏比例法培養(yǎng)和藥敏;痰快速培養(yǎng)和藥敏用的是BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:結(jié)果用SPSS 17.0分析軟件作卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨機(jī)選取兩組肺結(jié)核感染患者各60例，分別用耐藥突變基因?qū)嶒?yàn)和痰快速培養(yǎng)藥敏對(duì)比檢測:利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的藥敏耐藥結(jié)果的百分率分別為35.00%、21.67%，56.67%、45.00%，36.67%、31.67%，16.67%、10.00%。χ2分別為 2.627，0.989，0.333，1.154，P 值均＞0.05，說明兩種方法的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 耐藥突變基因和痰快速培養(yǎng)藥敏四種藥物耐藥結(jié)果百分率情況 例(%)

2.2 若不考慮耐多藥情況，只計(jì)算每種藥物的耐藥和耐藥突變位點(diǎn)，對(duì)91例耐藥肺結(jié)核疾病患者應(yīng)用耐藥突變基因檢測藥敏結(jié)果，利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的耐藥率分別是48.35%(44/91)，94.51%(86/91)，49.45%(45/91)，25.27%(23/91)。四種藥物相應(yīng)最常見突變位點(diǎn)分別為S531L、－15M、43M、306M2，分別占該藥突變位點(diǎn)檢出總數(shù)的 59.09%、70.93%、60.00%、73.91%，見表 2。

表2 結(jié)核病患者耐藥基因突變位點(diǎn)情況

3 討論

本試驗(yàn)應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒和痰快速培養(yǎng)藥敏方法對(duì)兩組肺結(jié)核感染患者各60例藥敏耐藥結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，得出的利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的耐藥百分率分別為 35.00%、21.67%，56.67%、45.00%，36.67%、31.67%，16.67%、10.00%。χ2分別為 2.627，0.989，0.333，1.154，P 值均 ＞0.05，說明兩種方法的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，耐藥突變基因檢測方法與傳統(tǒng)方法相比較沒有差異，具有較高敏感性，接近國外報(bào)道［2－3］。說明耐藥突變基因檢測法具有靈敏度好、特異性高、假陽性率低的特點(diǎn)，為臨床制定合理的治療方案提供可靠的客觀依據(jù)。

本研究結(jié)果表明耐藥突變基因檢測方法在檢測結(jié)核感染患者方面比其他方法更加快速、準(zhǔn)確性沒有差異，其鑒別診斷價(jià)值也得到了廣泛的認(rèn)可，對(duì)臨床診斷治療十分重要。主要原因由于痰液細(xì)菌學(xué)檢查的局限性，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)藥敏需時(shí)過長，平均16.2 d。耐藥突變基因檢測可直接運(yùn)用痰樣進(jìn)行檢測，無須培養(yǎng)，僅需要不到2 d時(shí)間，縮短了耐藥檢測的時(shí)間。對(duì)MTB的臨床樣本最低檢測限為1.0 ×104copies/mL［4］。耐藥突變基因檢測在結(jié)核感染耐藥藥物治療方面優(yōu)于其他方法，初治結(jié)核病人進(jìn)行耐藥檢測，在治療前就了解病人的耐藥情況，可以減輕初治耐藥病人的負(fù)擔(dān)。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示最常見突變位點(diǎn)為－15M，其余依次為43M，S531L，315M，88M，306M2。四種藥物相應(yīng)最常見突變位點(diǎn)分別為S531L、－15M、43M、306M2，分別占該藥突變位點(diǎn)檢出總數(shù)的 59.09%、70.93%、60.00%、73.91%。肺結(jié)核疾病患者利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的耐藥率分別是48.35%，94.51%，49.45%，25.27%。這一結(jié)果與沈陽［5］，南寧［6］等地區(qū)結(jié)核病患者耐藥結(jié)果不同，提示不同地區(qū)結(jié)核桿菌流行菌株可能不同。為治療中和治療后結(jié)核病人提供重要的耐藥信息，指導(dǎo)臨床合理用藥，有利于結(jié)核病的個(gè)體化治療。保證治療效果及減少耐藥菌株的擴(kuò)散。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床診療指南(結(jié)核病分冊(cè)).北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:64 －86.

［2］ 單萬水，吳馳，陳心春等.基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測中的應(yīng)用［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，11:112－114.

［3］ Wade MM，Volokhov D，Peredelchuk M，et al.Accurate mapping of mutations of pyrazinamide－resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning － frame oligonucleotide microarray［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2004，49(2):89 －97.

［4］ Maureen Morgan，Shriprakash Kalantri，Laura Flores，et al.A commercial line probe assay for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis:a systematic review and meta－ analysis［J］.BMC Infect Dis，2005，5:62.

［5］ 奚瑩，王莉.301例肺結(jié)核患者痰培養(yǎng)陽性菌株耐藥情況分析［J］.中國醫(yī)師雜志，2010，12(11):1561 －1563.

［6］ 孫亞紅.1207例結(jié)核桿菌耐藥分析［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2011，33(11):1492－1493.