張媛媛,侯衛(wèi)平,曹雪嬌,袁發(fā)煥

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科/全軍腎臟病中心/重慶市腎臟病研究所/國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)專科,重慶 400037)

腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是由多種不同病理類型的腎小球疾病所引起，臨床上表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和水腫,是腎臟疾病最常見的綜合征之一,長期持續(xù)發(fā)展將致腎功能障礙。局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)為腎病綜合征的一種常見病理類型，同時伴有相應(yīng)的腎小管間質(zhì)急、慢性炎性病變?yōu)槠滹@著的病理特征，大約30%～50% FSGS患者在5～20年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病[1]。通過阿霉素誘導(dǎo)的FSGS動物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎組織中炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18在的表達(dá)顯著升高，并與腎組織病理損害程度和腎功能血生化指標(biāo)密切相關(guān)[2-3]。在NS患者尿液中發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-18均有升高[4-5]。然而在FSGS患者腎組織中IL-1β、IL-18的表達(dá)情況以及是通過何種通路激活目前尚不清楚。目前研究資料提示，上游NLR NALP3炎性復(fù)合體是激活I(lǐng)L-1β、IL-18的重要通路[6]。NALP3炎性復(fù)合體是NLRs炎性體家族成員之一，主要表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞發(fā)揮啟動炎性體裝配的作用。NALP3炎性復(fù)合體由核心蛋白NALP3、銜接蛋白ASC、效應(yīng)蛋白caspase-1以及Cardinal組成的多蛋白復(fù)合體。當(dāng)危險信號作用于靶細(xì)胞，NALP3可以通過激活A(yù)SC和caspase-1，剪切IL-1家族成員前體成為具有活性的促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-18，從而放大病變微環(huán)境炎癥瀑布效應(yīng)[7-8]。因此推測，NALP3信號通路在FSGS患者腎小管間質(zhì)損害中發(fā)揮重要作用。本研究通過臨床收集FSGS患者腎組織標(biāo)本，觀察腎組織NALP3炎性復(fù)合體和細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)變化情況，結(jié)合腎小管間質(zhì)病理損害程度、F4/80的表達(dá)變化和臨床生化檢測結(jié)果，探討NALP3炎性復(fù)合體在FSGS中表達(dá)及作用，從而進(jìn)一步揭示FSGS的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 依據(jù)NS診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取2011年3月至2013年3月本院腎內(nèi)科收治的臨床診斷為NS的患者42例，經(jīng)腎穿刺活檢術(shù)及病理學(xué)檢查明確診斷為FSGS 26例(FSGS組)，其中男16例，女10例，平均年齡(39±8)歲；對照組 16例，其中男10例，女6例，平均年齡(41±10)歲。對照組腎組織標(biāo)本均取自腎錯構(gòu)瘤患者腎切除遠(yuǎn)離錯構(gòu)瘤部位的腎組織，經(jīng)光鏡檢查均證實(shí)為正常的腎組織。收集患者治療前各生化指標(biāo)：24 h尿蛋白定量、血肌酐、血尿素、血漿總蛋白、血漿清蛋白。計算腎小球?yàn)V過率(eGFR)，eGFR[mL/(min·1.73 m2)]=186×SCr-1.154×年齡-0.203×0.742(女)×1.233(中國)[9]。

1.2腎小管間質(zhì)病理分級情況 參照腎小管間質(zhì)損傷(tubulointerstitial damage,TID)評分的方法，對FSGS腎小管間質(zhì)的病變進(jìn)行半定量評分,根據(jù)光鏡下腎小管變性、壞死，腎小管萎縮，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤及間質(zhì)纖維化4個指標(biāo)作為評分依據(jù)，按照病變范圍及嚴(yán)重程度分為4個等級：0分，無腎小管和腎間質(zhì)病變；1分，輕度病變(小于總面積的25%)；2分，中度病變(占總面積的25%～50%)；3分，重度病變(大于總面積的50%)[10]。每張切片在低倍視野下(×100倍)隨機(jī)選取10個視野，取其平均值。上述結(jié)果分析均采用盲法進(jìn)行，由2名與本研究無關(guān)病理專業(yè)人員進(jìn)行評定。

1.3主要試劑 兔抗人NALP3抗體購于美國Millipore公司，ASC抗體購于美國LifeSpan Biosciences公司，caspase-1、IL-1β、IL-18、F4/80抗體均購美國Abcam公司?？剐∈蠡蛲眉从眯头巧锼孛庖呓M化EliVisionTMsuper 檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，封閉用正常山羊血清工作液、顯色試劑盒均購自北京中衫金橋生物技術(shù)公司。

1.4腎組織切片NALP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、F4/80的表達(dá)檢測 腎組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，切2 μm厚切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水洗后，行微波抗原修復(fù)，3%H2O2室溫15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶后，分別滴加：兔抗人NALP3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人caspase-1多克隆抗體(1∶50)、兔抗人ASC多克隆抗體(1∶200)、兔抗人IL-1β多克隆抗體(1∶200)、兔抗人IL-18多克隆抗體(1∶200)，大鼠抗人F4/80單克隆抗體(1∶50)，4 ℃冰箱內(nèi)過夜，0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入二抗工作液，在光鏡下控制DAB溶液染色，蘇木素復(fù)染，水洗脫水、透明后中性樹膠封片，陰性對照以PBS代替一抗，其他操作同前。

采用LEICA光學(xué)顯微鏡(400×)觀察采集圖像。每個切片隨機(jī)測定5個視野，應(yīng)用Image Pro Plus圖像分析軟件測量每一視野中陽性染色區(qū)域的積分光密度值(IOD)與測量區(qū)域的面積(area)，計算平均光密度(mean density)=(IOD SUM)/area對免疫組化染色進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者腎組織NALP3/ASC/caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)變化及相關(guān)性分析 免疫組化結(jié)果顯示，對照組腎小管上皮細(xì)胞NALP3有少量表達(dá)，ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18不表達(dá)，在FSGS組中，NALP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯增強(qiáng)，免疫組化染色呈棕黃色，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核呈陰性，見圖1～5。通過Pearson相關(guān)分析顯示，NALP3/ASC/caspase-1與IL-1β、IL-18的表達(dá)均呈正相關(guān)，見表1。

A:對照組;B:FSGS組；箭頭所指為表示陽性表達(dá)。

圖1兩組患者腎小管上皮細(xì)胞NALP3的表達(dá)變化(×400)

A:對照組;B:FSGS組；箭頭所指為表示陽性表達(dá)。

圖2兩組患者腎小管上皮細(xì)胞ASC的表達(dá)變化(×400)

A:對照組;B:FSGS組；箭頭所指為表示陽性表達(dá)。

圖3兩組患者腎小管上皮細(xì)胞caspase-1的表達(dá)變化(×400)

A:對照組;B:FSGS組；箭頭所指為表示陽性表達(dá)。

圖4兩組患者腎小管上皮細(xì)胞IL-1β的表達(dá)變化(×400)

A:對照組;B:FSGS組；箭頭所指為表示陽性表達(dá)。

圖5 兩組患者腎小管上皮細(xì)胞IL-18的表達(dá)變化(×400)

表2 腎小管間質(zhì)損傷評分比較

a:P<0.01,與對照組比較。

2.2兩組患者腎間質(zhì)病理評分及巨噬細(xì)胞檢測 與對照組相比，F(xiàn)SGS組患者腎小管間質(zhì)損傷評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。免疫組化結(jié)果顯示，對照組腎間質(zhì)F4/80有少量表達(dá)，在FSGS組中，F(xiàn)4/80表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要表達(dá)于腎小管間質(zhì)活化巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜，免疫組化染色呈棕黃色。見圖6。

2.3FSGS患者腎小管上皮細(xì)胞NALP3/ASC/caspase-1、IL-1β、IL-18與腎小管間質(zhì)損傷程度及F4/80的相關(guān)性分析 患者腎小管上皮細(xì)胞NALP3/ASC/caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)與腎小管間質(zhì)損傷程度及F4/80的表達(dá)呈正相關(guān)，見表3。

A:對照組;B:FSGS組；箭頭所指為表示陽性表達(dá)。

圖6兩組患者腎小管間質(zhì)F4/80的表達(dá)變化(×400)

2.4兩組患者腎小管上皮細(xì)胞NALP3、caspase-1、IL-1β、IL-18與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性 與對照組相比，F(xiàn)SGS患者尿蛋白、血肌酐、尿素、eGFR、血清總蛋白、清蛋白差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)SGS患者腎小管上皮細(xì)胞NALP3、caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平與尿素、血漿總蛋白、清蛋白的水平無顯著相關(guān)，與尿蛋白、血肌酐呈正相關(guān)(P<0.05)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表5。

表3 NALP3/ASC/caspase-1、IL-1β、IL-18與腎小管間質(zhì)評分及F4/80的相關(guān)性

表4 兩組患者各臨床生化指標(biāo)比較

a:P<0.01，與對照組比較。

表5 NALP3、caspase-1、IL-1β、IL-18與腎小管間質(zhì)損傷及臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

FSGS是NS的一種常見的病理類型，光鏡下病理特征為病變呈局灶、節(jié)段分布，表現(xiàn)為受累節(jié)段的硬化(系膜基質(zhì)增多、毛細(xì)血管閉塞、球囊粘連等)，同時伴有顯著的腎小管間質(zhì)急、慢性炎性病變，而且腎小球病損程度往往與腎小管間質(zhì)病變程度呈正相關(guān)[11-12]。

IL-1β主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，能進(jìn)一步觸發(fā)炎性反應(yīng)，在局部和全身炎性反應(yīng)中起到了核心作用。通過FSGS動物模型發(fā)現(xiàn)，模型小鼠比正常對照小鼠腎組織中IL-1β表達(dá)明顯升高[2]。IL-18主要由活化的巨噬細(xì)胞生成，能刺激Th1細(xì)胞分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IFN-γ以及IL-2，并能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過蛋白結(jié)合的方式減少IL-18的表達(dá)，能減輕FSGS模型小鼠蛋白尿、腎組織損傷程度、腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的數(shù)量以及炎性因子表達(dá)，說明IL-18在FSGS的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要的角色[3]。此外，既往研究證明腎病綜合征患者尿中IL-18水平明顯升高,并與尿蛋白存在明顯相關(guān)性[5]。

NALP3炎性復(fù)合體是IL-1β、IL-18活化的重要信號通路。NLRs炎性體是機(jī)體多種非特異性天然免疫危險信號刺激抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)的一類蛋白復(fù)合體，其對機(jī)體獲得性免疫反應(yīng)具有重要調(diào)控作用[13]。NALP3炎性體是NLRs炎性體家族成員之一，由NALP3，銜接蛋白ASC和Cardinal，以及caspase-1組成蛋白復(fù)合體,主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、DCs等APC發(fā)揮啟動炎性體裝配的作用[7]。NALP3炎性體能感受胞質(zhì)內(nèi)多種微生物產(chǎn)物和代謝性應(yīng)激，一旦危險信號作用于靶細(xì)胞，NALP3立即發(fā)生寡聚化，募集ASC和Cardinal，激活caspase-1，剪切IL-1家族成員前體成為具有活性的IL-1β、IL-18促炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)而放大病變微環(huán)境炎癥瀑布效應(yīng)[8]。Wang等[14]認(rèn)為阿霉素誘導(dǎo)的腎病綜合征小鼠通過ATP受體P2X7可誘導(dǎo)NALP3炎性體活化導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子釋放從而損傷腎組織。Vilaysane等[15]對CKD患者研究發(fā)現(xiàn)FSGS患者腎組織中NALP3 mRNA表達(dá)顯著增高，且與腎功能惡化程度顯著相關(guān)；通過輸尿管梗阻實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比NALP3基因敲出小鼠腎組織炎癥浸潤和纖維化程度明顯減輕，其原因可能是caspase-1活性下降以及IL-1β和IL-18成熟受阻。但在FSGS型腎病綜合征患者腎組織標(biāo)本中NALP3炎性復(fù)合體和IL-1β、IL-18表達(dá)情況如何及二者關(guān)系均未見相關(guān)研究報道。對此本研究首次檢測并分析它們在FSGS患者腎組織中的表達(dá)及意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NALP3/ASC/caspase-1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，在正常對照組中NALP3有表達(dá)但表達(dá)較弱，ASC、caspase-1均無表達(dá)，而在FSGS患者腎組織中NALP3、ASC、caspase-1表達(dá)明顯升高。同時發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-18均有同樣的表達(dá)趨勢，進(jìn)一步分析顯示NALP3/ASC/caspase-1與IL-1β、IL-18表達(dá)變化顯著相關(guān)。提示在FSGS患者腎組織中NALP3炎性復(fù)合體可能是IL-1β、IL-18的重要激活通路。

同時發(fā)現(xiàn)在NALP3/ASC/caspase-1及IL-1β、IL-18表達(dá)高的部位，其周圍炎癥細(xì)胞明顯增加，通過相關(guān)性分析NALP3/ASC/caspase-1和IL-1β、IL-18的高表達(dá)與患者腎小管間質(zhì)損傷程度以及F4/80的陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)、尿蛋白及腎功能損害呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)。提示NALP3炎性復(fù)合體過表達(dá)是FSGS患者腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤的重要原因。

綜上所述，NALP3炎性復(fù)合體通過激活I(lǐng)L-1β、IL-18等下游炎癥因子，參與FSGS的發(fā)病機(jī)制，其表達(dá)程度越高、腎組織病變程度越重，是否能作為FSGS預(yù)后的預(yù)警指標(biāo)，還需進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證。

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