宗 鵬，李鳳霞，王 倩，劉貫山，龔達(dá)平，陳雅瓊，孫玉合*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,煙草行業(yè)基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081)

煙草 TILLING 技術(shù)體系的建立及 NtPhyB 基因的篩選

宗 鵬1,2，李鳳霞1，王 倩1，劉貫山1，龔達(dá)平1，陳雅瓊1,2，孫玉合1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,煙草行業(yè)基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081)

定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)(Targeting Induced Local Lesions In Genomes，TILLING)是一種新近發(fā)展起來(lái)的高通量檢測(cè)點(diǎn)突變的反向遺傳學(xué)方法。本研究首次將 TILLING 技術(shù)用于 EMS 處理的煙草突變體篩選中，通過(guò)對(duì)正反向熒光引物使用量的摸索，確定了 10 μL PCR 體系中 IRDye-700 標(biāo)記的正向引物(1 μM)適用量為 0.32～0.64 μL，IRDye-800 標(biāo)記的反向引物(1 μM)適用量 1.12～1.6 μL；對(duì)異源雙鏈 CEL Ⅰ酶切體系實(shí)驗(yàn)表明，10 μL PCR 產(chǎn)物中加入 0.6 μL CEL I 酶，1.5 μL 10× Buffer酶切效果最好。從而建立并優(yōu)化了適用于普通煙草基因組研究的 TILLING 技術(shù)體系。在此基礎(chǔ)上，以 NtPhyB為目標(biāo)基因，在 1000 份 0.6% EMS 誘變的 M2 突變體中進(jìn)行篩選，共得到 13 個(gè)突變體，該基因突變頻率約為 1/94 kb。本試驗(yàn)建立的 TILLING 篩選體系能夠快速、高效地篩選任意已知序列基因的突變體，對(duì)煙草功能基因組研究具有重要意義。

功能基因組學(xué)；TILLING；煙草；化學(xué)誘變；突變體

定 向 誘 導(dǎo) 基 因 組 局 部 突 變 技 術(shù) (Targeting Induced Local Lesions In Genomes,TILLING)是一種高效地對(duì)化學(xué)誘變產(chǎn)生的突變體進(jìn)行篩選的方法,它能夠?qū)蚪M任何一個(gè)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,通過(guò)創(chuàng)建特定基因的突變體來(lái)研究一個(gè)基因的功能。由于這類突變?nèi)后w具有低水平的異倍性、致死率和高密度的突變率[1],在功能基因鑒定和分子輔助育種中有很大優(yōu)勢(shì)。TILLING 現(xiàn)已經(jīng)成功應(yīng)用于擬南芥、小麥、玉米、水稻、大豆等很多動(dòng)植物突變體篩選中[2-18]。

TILLING 技術(shù)檢測(cè)經(jīng)典方法為熒光引物標(biāo)記法,其核心是對(duì)突變位點(diǎn)處形成的異源雙鏈進(jìn)行特異性酶切,再通過(guò) 700、800 nm 波長(zhǎng)下雙色紅外熒光檢測(cè)酶切片段的大小確定突變位點(diǎn),由于此方法紅外熒光檢測(cè)干擾低,因此該方法具有假陽(yáng)性低、成本低、通量較高等優(yōu)點(diǎn)。目前擬南芥 TILLING項(xiàng)目(Arabidopsis TILLING Project, ATP)、百脈根(Lotus japonicus)TILLING 項(xiàng)目以及在水稻、小麥等植物上進(jìn)行的突變體篩選均是利用該方法進(jìn)行[1-2,6,18],通過(guò)該方法分離、鑒定了大量與生長(zhǎng)發(fā)育、農(nóng)藝性狀等相關(guān)的基因[1-2],加快了其功能基因研究速度。

煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,也是植物生物技術(shù)研究的模式植物。2011 年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所構(gòu)建了數(shù)萬(wàn)份普通煙草 EMS誘變的飽和突變體庫(kù),可以進(jìn)行大規(guī)模的煙草功能基因鑒定。本項(xiàng)目通過(guò)摸索煙草 TILLING 的異源雙鏈酶切、PCR反應(yīng)中熒光引物的相對(duì)含量等條件,建立并優(yōu)化煙草突變體 TILLING 篩選方法,并用于煙草 NtPhyB基因的篩選,該方法的建立將為大規(guī)模進(jìn)行煙草發(fā)育、品質(zhì)、抗病、煙堿代謝等相關(guān)基因的突變體篩選、基因功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為 0.6% EMS 處理的中煙 100 M2 代突變體共 1000 個(gè)株系,2011 年種植于山東省諸城市。TILLING 檢測(cè)采用 DNA 分析儀(Licor4300, American)進(jìn)行,變性 PAGE 膠、標(biāo)記 Marker購(gòu)自GENE 公司。熒光標(biāo)記引物由寶生物工程(大連)公司合成,普通引物由 Invitrogen 公司合成。

1.2 TILLING 篩選體系方法

1.2.1 DNA 提取、均一化和 DNA 四倍池的建立M2突變單株DNA的提取采用TIANGEN試劑盒進(jìn)行,通過(guò)瓊脂糖電泳以及紫外分光光度法測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量,并將每個(gè) DNA 濃度稀釋至 40 ng/μL。取 M2 單株 DNA 20 μL,每 4 個(gè)單株混于 96 孔板中一個(gè)孔,構(gòu)建四倍混合池。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及異源雙鏈的重組 根據(jù)絨毛狀煙草和林煙草中煙草 II型光敏色素基因(Nicotiana tabacum type II phytochrome gene, NtPhyB)的序列,利 用 CODDLE(Codons Optimized to Discover Deleterious Lesions; http∶//www.proweb.org/input/)程序設(shè)計(jì)引物 NtPhyB-F:5'-CTTTTTCAACTTAATAT CTTTTA-3'；NtPhyB-R:5' -CTAGCAGAAGTATGG TGTCCAAC-3'。10 μL PCR 反應(yīng)體系為:DNA 模板 1 μL；NtPhyB-F-IRDye700 0.032 μL；NtPhyB-F 0.128 μL；NtPhyB-R-IRDye800 0.288 μL；NtPhyB-R 0.032 μL；10× Buffer 1 μL；2.5 mM dNTP 1 μL；TAKARA Ex Taq 0.1 μL；ddH2O 8 μL；

PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s, 57 ℃ 30 s,每個(gè)循環(huán)降低 1 ℃,72 ℃ 1 min；10 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s,47 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min；45 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；99 ℃ 10 min；70 ℃ 20 s,每個(gè)循環(huán)降低 0.3 ℃,70 個(gè)循環(huán)。

1.2.3 CEL I 酶切重組異源雙鏈及酶切產(chǎn)物的純化CEL I 酶的提取參照韓鎖義的方法[19]。設(shè)置 12 種CEL I酶切體系切割陽(yáng)性對(duì)照(表1),酶切條件為45 ℃,30 min,酶切完成后用 5 μL 的 0.25 M EDTA終止反應(yīng)。在 15 μL 酶切產(chǎn)物中加入 25 μL H2O 和60 μL 異丙醇,-20 ℃過(guò)夜后,2400 g 平板離心 45 min后,倒掉上清液,加入 100 μL 70%乙醇洗脫,離心30 min,倒掉上清,晾干。待產(chǎn)物晾干后,向其加入 5 μL Blue Stop solution Buffer溶解。

表1 CEL I酶濃度梯度Table 1 Different concentration of the CEL I enzyme in Licor-TILLING system

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 變性聚丙烯酰胺凝膠制備用 6% Gene-PAGE Plus 20 mL,向其加入 15 μL TEMED 和 100 μL 10%過(guò)硫酸銨,混勻后迅速均勻地倒入膠板中,邊倒邊輕輕捶打,避免產(chǎn)生氣泡,待膠均勻地充滿膠板后,插上梳子,室溫下放置 1.5～2 h。在點(diǎn)樣之前,樣品 95 ℃變性 2 min后放置冰上,吸取 0.5 μL 加入點(diǎn)樣槽。電泳條件:預(yù)電泳電壓,1500 V,電流 40 mA,功率 40 W,時(shí)間 10 min；電泳時(shí)電壓 1500 V,電流 40 mA,功率40 W,時(shí)間 195 min,溫度設(shè)置為 50 ℃,GelBuddy圖像分析(Licor4300, American)軟件分析電泳結(jié)果。

1.2.5 突變單株測(cè)序驗(yàn)證及突變頻率分析 將有突變位點(diǎn)的混合池中的 4個(gè)單株分別進(jìn)行酶切檢測(cè),獲得有突變位點(diǎn)的突變個(gè)體,并對(duì)其 PCR 產(chǎn)物雙向測(cè)序,獲得突變位點(diǎn)信息。計(jì)算 NtPhyB 在突變?nèi)后w的突變頻率,計(jì)算公式為:突變頻率=1/(篩選片段總長(zhǎng)×篩選模板數(shù)目/篩選出突變位點(diǎn)個(gè)數(shù))。

2 結(jié) 果

2.1 DNA 提取、濃度均一化

采用 TIANGEN試劑盒提取的DNA質(zhì)量較好, DNA 濃度在 41～200 ng/μL 之間,將 DNA 樣品根據(jù)其原始濃度用雙蒸水稀釋至 40 ng/μL,用于四倍混合池的構(gòu)建(圖 1)。

圖1 DNA 質(zhì)量的檢測(cè)與稀釋Fig. 1 Determination of DNA quality and it's dilution to desired concentration注:左側(cè)為稀釋前 DNA,上樣品 3 μL；右側(cè)為濃度均一化后的 DNA,上樣品 5 μL。

2.2 熒光標(biāo)記引物用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

PCR 反應(yīng)體系中熒光標(biāo)記引物使用量決定了電泳圖譜的清晰度,直接影響著突變位點(diǎn)的鑒定結(jié)果,在本試驗(yàn)中,10 μL PCR 體系中加入 0.32～0.64 μL 1uM 的熒光標(biāo)記的正向引物 NtPhyB-F-700,同時(shí)混合 0.96～1.28 μL 1uM 的非標(biāo)記正向普通引物NtPhyB-F；1.12～1.6 μL 1uM 的熒光標(biāo)記的反向引物 NtPhyB-2R-800,同時(shí)混合 0.16～0.48 μL 1uM 的反向普通引物 NtPhyB-R,電泳圖譜較好(圖 2)。

2.3 TILLING 篩選體系 CEL Ⅰ酶切割雜合雙鏈

CEL Ⅰ酶具有對(duì)堿基錯(cuò)配的 DNA 雙鏈在堿基錯(cuò)配處進(jìn)行準(zhǔn)確切割的功能,用 12 種酶切體系切割已知堿基錯(cuò)配的 PCR 產(chǎn)物(表1),得到最適合用于煙草 TILLING 的 CEL Ⅰ酶量:IV 號(hào)酶切體系(10 μL PCR 產(chǎn)物,0.6 μL CEL I酶,1.5 μL 10× Buffer,2.9 μL ddH2O)適合用于煙草 TILLING 中(圖 3)。

圖2 不同熒光引物使用量的檢測(cè)電泳圖Fig. 2 Different intensity of fluorescence produced by fluorescent-marked primer.注:左側(cè)為 700 nm 通道,右側(cè)為 800 nm 通道；框內(nèi)表示適宜的熒光引物濃度范圍。

圖3 檢測(cè) CEL I濃度梯度酶切結(jié)果Fig. 3 Digestion of heteroduplex PCR products by different concentrations of CEL I enzyme注:Marker 為 Transgen 公司 DL2,000。白色箭頭指出的為酶切后的一條帶。I 為空白對(duì)照,排除了其為 PCR 擴(kuò)增非特異帶。I,II,III,IV, V,VI,VII,VIII,IX,X,XI,XII 對(duì)應(yīng)表2 酶切體系。

2.4 TILLING 體系篩選四倍庫(kù)結(jié)果

用上述 PCR 擴(kuò)增體系和酶切體系篩選 M2 代DNA 四倍混合池,通過(guò) LICOR-4300 檢測(cè),700 nm通道電泳圖譜和 800 nm 通道電泳圖譜在同一電泳道上,各出現(xiàn)一個(gè)特異條帶,且兩個(gè)條帶的大小之和等于主帶大小,表明此 DNA 混合四倍池中有突變體(圖 4)。在 250 個(gè)混合池中,共獲得了 13 個(gè)含有 NtPhyB 基因突變位點(diǎn)的混合池。

2.5 確定 NtPhyB 突變單株及突變頻率

將檢測(cè)到的含有 NtPhyB 基因突變的四倍體混合池中各突變單株 DNA 與 20 ng/μL 的野生型中煙100 混合,再經(jīng)過(guò)異源雙鏈形成和 CEL I酶切過(guò)程,確定了 NtPhyB 基因的 13 個(gè)突變單株(圖 5),該基因在群體的突變頻率=1/(1223×1000/13)≈1/94 kb。

圖4 TILLING 篩選四倍庫(kù) NtPhy 基因突變體電泳圖Fig. 4 The output of NtPhy mutations screened through Licor-TILLLING system in tetraploidy pools注:左側(cè)為 700 nm 通道,右側(cè)為 800 nm 通道。方框中框出的兩個(gè)突變條帶,并在最右邊進(jìn)行了放大。

圖5 Licor-TILLING 確定 NtPhy 突變單株電泳圖譜Fig. 5 The spectrum of NtPhy mutations in mutant plants by Licor-TILLING system.注:左側(cè)為 700 nm 通道,右側(cè)為 800 nm 通道。在同一泳道,兩張圖譜被分離的片段大小之和等于主帶,表示此處有點(diǎn)突變。

3 討 論

3.1 熒光引物用量

基 于 Licor 4300 的 基 因 分 析 系 統(tǒng) 在 進(jìn) 行TILLING 篩選時(shí),熒光信號(hào)強(qiáng)弱直接影響著圖譜質(zhì)量,若 PCR 反應(yīng)體系中全部為熒光標(biāo)記引物或者使用的熒光引物過(guò)多,不僅會(huì)造成電泳圖譜色深,對(duì)電泳條帶的觀察造成干擾,而且成本增加；若使用的熒光引物過(guò)少,則導(dǎo)致電泳圖譜色淺,可能觀察不到電泳條帶。另外,Dye800 的熒光信號(hào)比 Dye700低,因此,調(diào)整兩種引物的含量非常重要。Colbert T 等[20]的研究表明,當(dāng)將一對(duì)分別用 700、800 nm熒光染料標(biāo)記的引物和沒(méi)有標(biāo)記的引物混和后進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)非常穩(wěn)定,因此,可以通過(guò)在 PCR 體系中加入一定量的普通引物來(lái)平衡熒光引物的使用量,來(lái)調(diào)整圖譜效果。在擬南芥、水稻 TILLING 體系中,熒光引物與普通引物比例一般為正向引物 3∶2,反向引物為 4∶1[21-22]。通過(guò)摸索,我們確定了煙草 10 μL PCR 體系中熒光引物與普通引物比例約為正向引物比例為 2∶3,反向引物比例約 7∶1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與水稻體系略有不同,可能是同一種熒光標(biāo)記引物,不同公司合成的熒光標(biāo)記引物熒光信號(hào)強(qiáng)度也不同。

3.2 突變頻率對(duì)煙草功能基因研究的影響

本研究中,NtPhyB 基因在 0.6% EMS 處理的M2 代突變?nèi)后w的突變頻率約為 1/94 kb,這意味著在一個(gè)普通煙草突變株中,整個(gè)基因組上約有46 000 個(gè)左右的突變位點(diǎn)。這種突變頻率與四倍體小麥 1/40 kb[2]比較接近,而與二倍體植物如擬南芥、水稻的突變頻率(1/170 kb、1/500 kb)相差較大。本研究中普通煙草較高的突變頻率可能與其是多倍體有關(guān),由于多倍體中同源基因的存在,使其對(duì)點(diǎn)突變的耐力增強(qiáng),所以飽和突變體庫(kù)中點(diǎn)突變頻率較高。較高的突變頻率,可以保證在相對(duì)較少量的突變?nèi)后w里包含豐富的突變類型,但較高的突變頻率也使得表型分析相對(duì)困難,尤其對(duì)功能未知的基因,確定其突變表型與基因突變的相關(guān)性有一定的難度。

3.3 TILLING 技術(shù)在煙草上的應(yīng)用前景

TILLING 技術(shù)依賴于飽和突變?nèi)后w材料和完整的基因序列信息。目前,普通煙草有數(shù)萬(wàn)份的飽和突變體材料,其祖先親本絨毛狀煙草(N. tomentosiformis)和林煙草(N. sylvestris)的全基因組也已經(jīng)測(cè)序完成,理論上普通煙草任意基因的突變體都可以找到。然而,TILLING 技術(shù)應(yīng)用于煙草功能基因鑒定又有一定的困難,首先,多拷貝基因的存在使得普通煙草突變基因功能驗(yàn)證比二倍體難度高,往往需要同時(shí)篩選相似性較高的幾個(gè)或幾十個(gè)基因,篩選和鑒定的工作量比較大；其次,煙草是一種注重品質(zhì)的作物,在篩選控制次生代謝的功能基因突變體時(shí),表型分析即相應(yīng)代謝產(chǎn)物的變化檢測(cè)較為復(fù)雜。因此,利用 TLLING 技術(shù)鑒定普通煙草基因功能,還要從簡(jiǎn)單、易檢測(cè)的性狀入手,再逐步深入。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)正反向熒光引物使用量的摸索以及異源雙鏈 CEL Ⅰ酶切體系實(shí)驗(yàn),建立并優(yōu)化了煙草 TILLING 篩選體系。并利用該體系在 1000 份突變體中進(jìn)行篩選,得到了 13個(gè)突變單體,預(yù)測(cè)該基因突變頻率約為 1/94 kb。本研究對(duì)未來(lái)煙草重要功能基因分析奠定了重要基礎(chǔ)。

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Establishment of TILLING in Tobacco and its Application to Screen the NtphyB Gene in Mutant Populations

ZONG Peng1,2, LI Fengxia1, WANG Qian1, LIU Guanshan1, GONG Daping1, CHEN Yaqiong1,2, SUN Yuhe1*
(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)

Targeting Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a newly developed high-throughput reverse genetic method used for detection of point mutations. We used TILLING technology to screen EMS treated tobacco mutant population. The concentration of forward and reverse fluorescent labeled primers was determined∶ the 10 μL PCR mix consisted of 0.32 ～ 0.64 μL (1 μM) fluorescence-labeled forward primer and 1.12 ～ 1.6 μL (1 μM) fluorescence-labeled reverse primer. The 10 μL PCR product was used as a substrate for the CEL I digestion. The concentration of CEL I enzyme and 10× buffer optimized to cut the heteroduplex was 0.6 μL and 1.5 μL respectively. This optimized and established TILLING system was applied to screen the NtPhyB gene in 1000 (0.6% EMS mutagenized) M2 mutant population. The screening procedure provided a total of 13 mutants. The gene mutation frequency of approximately 1/94 kb was obtained. TILLING screening system established in our study is faster and efficient for mutant genes of any known sequence and can play a vital role in tobacco functional genomics research in future.

functional genomics; TILLING; tobacco; chemical mutagenesis; mutant

S572

1007-5119(2014)02-0032-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.02.006

中國(guó)煙草總公司煙草基因組計(jì)劃重大專項(xiàng)項(xiàng)目―煙草突變體庫(kù)創(chuàng)制、篩選與分析”[110201101009(JY-03)]；―煙草突變體篩選與鑒定”[110201201004(JY-04)]；―煙草突變體庫(kù)創(chuàng)建與功能基因組學(xué)研究”(110200701022)

宗 鵬,男,碩士研究生,研究方向?yàn)榉肿佑N。E-mail:zongpeng037@163.com。*通信作者,E-mail:yhsun@163.com

2013-02-21

2013-12-17