屈 旭，丁安明，劉少云，呂國新，王永利，許永幸，李毅君*

(1.青島中煙種子有限責(zé)任公司,青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,青島 266101；3.山東青島煙草有限公司,青島 266101)

不同生長物質(zhì)復(fù)配處理對烤煙種子萌發(fā)的影響

屈 旭1,2，丁安明2，劉少云1,2，呂國新3，王永利3，許永幸3，李毅君1,2*

(1.青島中煙種子有限責(zé)任公司,青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,青島 266101；3.山東青島煙草有限公司,青島 266101)

為了更好地提高煙草催芽種子的質(zhì)量，尤其是改善陳種子的萌發(fā)能力，實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的 MS 營養(yǎng)液、GA3、IBA、6-BA 及 4 者復(fù)配對 K326、NC89 新陳 2 類種子進(jìn)行催芽處理，統(tǒng)計(jì)分析不同條件催芽處理后的種子萌發(fā)率、各項(xiàng)生理生化指標(biāo)變化以及萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明，各因素單獨(dú)催芽處理，在適宜濃度范圍內(nèi)均能促進(jìn)種子萌發(fā)。而采用生長物質(zhì)復(fù)配配方(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA 和 1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA)催芽處理，種子萌發(fā)迅速且各項(xiàng)生理生化指標(biāo)顯著優(yōu)于對照。此外，WRKY2基因的表達(dá)量在催芽處理后顯著提高。

烤煙；生長物質(zhì)；種子萌發(fā)；生理生化指標(biāo)

煙草種子是煙葉生產(chǎn)的重要基礎(chǔ),種子活力的高低直接影響著煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)。然而種子的壽命具有一定的年限,由于在貯存過程中呼吸消耗強(qiáng)烈及萌發(fā)抑制物質(zhì)的存在,導(dǎo)致發(fā)芽率和發(fā)芽勢大大降低,幼芽生活力弱,難以獲得壯苗。研究表明,播前催芽處理能明顯提高種子活力,使播種后出苗整齊,幼苗健壯[1]。目前生產(chǎn)上主要使用水[2]和赤霉素溶液[3]對煙草種子進(jìn)行催芽處理。然而在種子萌發(fā)和幼苗生長過程中,除需要適宜的水分、溫度、光照和氧氣等外界條件外[4],植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)如IBA[5]、6-BA[6]及大量元素[7]、微量元素[8]同樣起著相當(dāng)重要的作用,尤其對幼苗的生理生化指標(biāo)起到一定的調(diào)控作用。故開展有關(guān)營養(yǎng)元素與植物生長調(diào)節(jié)劑相結(jié)合進(jìn)行種子催芽處理的研究尤為重要。

本研究采用不同濃度的 MS 營養(yǎng)液、GA3、IBA、6-BA 復(fù)配對煙草新、陳兩類種子進(jìn)行催芽處理,不僅觀察種子萌發(fā)狀態(tài)和幼苗生長情況,而且對幼苗的生理生化指標(biāo)及萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行測定,目的是尋找提高種子活力的最佳催芽條件,探討提高陳種子發(fā)芽率的處理方案以及促進(jìn)種子萌發(fā)的分子機(jī)理,為進(jìn)一步提高煙草催芽種子質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為南方煙區(qū)主栽品種 K326 和北方煙區(qū)主栽品種 NC89 的新陳兩類種子。新種子為 2011年繁殖；陳種子為 2003 年繁殖,已存放 9 年,均由青島中煙種子有限責(zé)任公司提供。

1.2 催芽處理與播種

種子用 0.1%硫酸銅溶液消毒 10 min,蒸餾水沖洗 3 次,30 ℃晾干至含水量 10%左右,然后用配好的溶液浸種催芽。MS 營養(yǎng)液設(shè) 0、1/50 MS、1/20 MS 3 個梯度；GA3設(shè) 0、100、300 mg/L 3 個濃度梯度；IBA 和 6-BA 各設(shè) 0、0.2、2、10 mg/L 4 個濃度梯度；4 種因素完全隨機(jī)組合成 144 個處理,每個處理 3 次重復(fù)。催芽在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行,12 h 光照/12 h 黑暗,溫度(27±1)℃,催芽 46 h[2]。催芽結(jié)束后,30 ℃晾干至含水量 7%左右[9],保存?zhèn)溆?。設(shè)未處理和水處理兩個對照。

將培養(yǎng)皿內(nèi)放入濕潤的脫脂棉墊,其上鋪一層濾紙。然后各處理挑選 300 粒種子,設(shè)置 3 次重復(fù),每一重復(fù)播種 100粒種子。置于人工光照培養(yǎng)箱內(nèi),溫度為(27±1)℃,12 h 光照/12 h 黑暗。

1.3 生理生化指標(biāo)測定及方法

點(diǎn)種后第 1～7 天,每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)種子的數(shù)量,繪制萌發(fā)曲線。將同一品種不同處理的種子在相同生長條件下播種 30 d 后,選擇某一株長勢較好的幼苗做標(biāo)準(zhǔn),然后分別從不同處理中挑選長勢與其相似的煙苗 100 株,測定苗高、根長及苗鮮質(zhì)量。參照參考文獻(xiàn)[10]的方法測定葉綠素含量、根系活力、過氧化物酶活性和硝酸還原酶活性。參照參考文獻(xiàn)[11]的方法測定不同處理種子浸提液電導(dǎo)率。

1.4 萌發(fā)相關(guān)基因 WRKY2 表達(dá)分析

分別提取催芽處理和未處理 NC89 新陳種子所育幼苗的總 RNA,按照 SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)的使用說明進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)程序參照參考文獻(xiàn)[12]。每個樣品重復(fù) 3 次。所用引物根據(jù) WRKY2(GenBank No. AF096299.1)和內(nèi)參核糖體蛋白基因 NtL25 的 mRNA 序列利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì),WRKY2 特異引物(正向:5’-CCCACTATTACTTTACCACCGC-3’和 反 向 :5’-ATCTCTGGCGGAGGGGGAAAAC-3’)及 NtL25 引物(正向:5’-CAAAAGTTACATTCCACCG-3’和反向:5’-TTTCTTCGTCCCATCAGGC-3’)。反應(yīng)完成后,用 ABI 7500 分析軟件對熒光定量結(jié)果進(jìn)行分析,并構(gòu)建相對定量表達(dá)圖。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度生長物質(zhì)對烤煙種子萌發(fā)的影響

2.1.1 MS 營養(yǎng)液催芽處理對種子萌發(fā)的彯響 不同濃度 MS 營養(yǎng)液對 K326 新種子催芽后,播種第 2天,1/20 濃度處理種子的萌發(fā)率達(dá)到 74%,1/50 濃度和水處理種子的萌發(fā)率為 50%,而未處理種子尚未萌發(fā)。第 3 天,除未處理種子的萌發(fā)率為 70%外,其他均達(dá)到 90%左右。第 4 天,4 種處理的種子萌發(fā)率達(dá)到同一水平且趨于穩(wěn)定(圖 1)。

2.1.2 GA3催芽處理對種子萌發(fā)的彯響 播種后第2 天,100 mg/L GA3處理種子的萌發(fā)率達(dá)到 94%,其他處理均在 50%以下(圖 2),說明此時 100 mg/LGA3對種子萌發(fā)的促進(jìn)作用較強(qiáng),高于此濃度,萌發(fā)率降低。但第 3 天,300、100 mg/L GA3處理種子的萌發(fā)率達(dá)到同一水平,且顯著優(yōu)于對照。

圖2 GA3催芽處理對 K326 新種子萌發(fā)率的影響Fig. 2 Effects of priming by GA3on on germination rate of K326 new seeds

2.1.3 IBA 催芽處理對種子萌發(fā)的彯響 煙草種子經(jīng) 0.2 mg/L IBA 處理后,第 2 天萌發(fā)率可達(dá) 78%；但隨著濃度增大,其促進(jìn)作用逐漸減弱,2 mg/L IBA處理的種子在第 2 天萌發(fā)率為 57%,10 mg/L IBA的促進(jìn)作用甚至低于水處理(圖 3)。表明 0.2～2 mg/L IBA 是促進(jìn)烤煙種子萌發(fā)的適宜濃度范圍。

圖3 IBA 催芽處理對 K326 新種子萌發(fā)率的影響Fig. 3 Effects of priming by IBA on on germination rate of K326 new seeds

2.1.4 6-BA 催芽處理對種子萌發(fā)的彯響 烤煙種子經(jīng) 0.2、2 mg/L 6-BA 處理后,第 2 天萌發(fā)率均達(dá)到 75%,但 10 mg/L 6-BA 的促進(jìn)作用顯著低于水處理；第 4 天,2 mg/L 6-BA 處理種子的萌發(fā)率超過 0.2 mg/L 處理,且各處理的萌發(fā)率趨于穩(wěn)定,經(jīng)6-BA 處理種子的最終萌發(fā)率高于對照(圖 4)。

圖4 6-BA 催芽處理對 K326 新種子萌發(fā)率的影響Fig. 4 Effects of priming by 6-BA on on germination rate of K326 new seeds

2.1.5 不同生長物質(zhì)復(fù)配處理對不同品種種子萌發(fā)的彯響 從 144 個處理組合中篩選出 3 種優(yōu)異配方 A(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA)、B(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA)和 C(1/20 MS+300 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA),分別對 K326 和 NC89 新陳種子進(jìn)行催芽處理,并對第2天萌發(fā)率進(jìn)行方差分析(表1)。結(jié)果表明,3 種配方對 K326 和 NC89新種子的催芽效果無顯著差異,但與對照差異顯著(p＜0.05)；A 和 B 配方對 K326 和 NC89 陳種子的催芽效果無顯著差異,但顯著優(yōu)于 C配方和對照(p＜0.05)；對 K326 和 NC89 種子的最佳催芽條件分別是配方B和A。

表1 不同生長物質(zhì)復(fù)配處理對烤煙種子第 2天萌發(fā)率的影響Table 1 Effects of priming by the combination of different growth regulators on the second day germination rate of tobacco seeds

2.2 不同生長物質(zhì)復(fù)配處理所引起的幼苗生理生化指標(biāo)的變化

2.2.1 幼苗生長量的變化 營養(yǎng)配方 A 和 B 處理能顯著提高根系長度、煙苗高度和煙苗鮮質(zhì)量,其中,根長均達(dá) 15.0 cm 以上,比對照增加 2.0 cm 之多(表2)。C 配方的促進(jìn)作用較小,與水處理相似。同時,配方處理種子所育煙苗均伴有大量側(cè)根出現(xiàn)。

2.2.2 葉綠素含量的變化 不同處理所育煙苗的葉綠素含量方差分析結(jié)果顯示(表3),對于新種子,除C處理的NC89外,葉綠素含量均顯著高于對照(p＜0.05)；對于陳種子,A 配方處理的幼苗葉綠素含量顯著高于其他處理(p＜0.05)。

表2 不同生長物質(zhì)復(fù)配處理對不同品種煙草幼苗生長素質(zhì)的影響Table 2 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling growth

表3 不同生長物質(zhì)復(fù)配處理對不同品種煙草幼苗葉綠素含量的影響 mg/gTable 3 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling chlorophyll content

2.2.3 TTC 法根系活力的變化 由表 4 看出,不同品種烤煙種子經(jīng)A和 B配方處理所育煙苗的根系TTC還原強(qiáng)度較C配方和對照處理顯著提高,且 A配方顯著優(yōu)于 B 配方(p＜0.05)。

表4 不同生長物質(zhì)復(fù)配處理對不同品種煙草幼苗根系活力的影響 ug/(g·h)Table 4 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling root activity

2.2.4 過氧化物酶活性的變化 新種子經(jīng) A 配方處理所育煙苗的過氧化物酶活性顯著優(yōu)于其他處理(p＜0.05),C 配方處理的效果甚至低于水處理；對于陳種子,A和B配方較好,且無顯著差異(表5)。

2.2.5 硝酸還原酶活性的變化 A 配方對 K326 新陳種子催芽處理后,所育煙苗的硝酸還原酶活性顯著高于其他處理(p＜0.05)；A 和 B 配方對于 NC89新陳種子的處理效果差異不顯著(表6)。

表5 不同生長物質(zhì)復(fù)配處理對不同品種煙草幼苗過氧化物酶活性的影響 U/(min·gFW)Table 5 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling peroxidase activity

表6 不同生長物質(zhì)復(fù)配處理對不同品種煙草幼苗硝酸還原酶的影響 ug/(gFW·h)Table 6 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling nitrate reductase activity

2.2.6 裸種浸提液電導(dǎo)率的變化 處理后的 NC89新陳種子浸提液電導(dǎo)率較對照顯著降低(p＜0.05),且 3 種配方間無顯著差異；對于 K326 新種子,A和 B 配方處理效果較好,而對于 K326 陳種子,C配方最好(表7)。

表7 不同生長物質(zhì)復(fù)配處理對不同品種煙草種子浸提液電導(dǎo)率的影響 us/cmTable 7 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seed leaching solution conductivity

2.3 催芽處理對 WRKY2 基因表達(dá)的影響

NC89新種子經(jīng)催芽處理所育煙苗中WRKY2的表達(dá)量分別是未處理的 2.2(A 配方)和 1.8(B 配方)倍；NC89陳種子經(jīng) A 配方處理后該基因的表達(dá)量是未處理的 2.7 倍(圖 5)。WRKY2 在未處理新種子中的表達(dá)量為陳種子的 3.4 倍。說明陳種子經(jīng)長時間貯存后相關(guān)基因的表達(dá)活性明顯降低,而催芽處理能顯著提高種子萌發(fā)或代謝相關(guān)基因的表達(dá)量,這種作用在陳種子中更為明顯。

圖5 WRKY2 基因的熒光定量表達(dá)分析Fig. 5 qRT-PCR analysis of WRKY2注:1～3 分別為未處理、A 和 B 配方處理的 NC89 新種子；4、5 分別為未處理和 A配方處理的 NC89 陳種子。

3 討 論

前人對種子催芽的研究成果主要集中在對水和 GA3溶液最佳催芽濃度的研究上[13-16]。然而植物生長物質(zhì)在種子萌發(fā)過程中也發(fā)揮非常重要的作用。故本研究將不同生長物質(zhì)復(fù)配對烤煙新陳種子進(jìn)行催芽處理,尋求最佳催芽條件,以提高烤煙催芽種子的質(zhì)量,尤其是探討對陳種子具有一定修復(fù)作用的萌發(fā)條件。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的 MS 營養(yǎng)液、GA3、IBA、6-BA 分別對烤煙種子進(jìn)行催芽處理。結(jié)果表明,各因素在一定濃度范圍內(nèi)均能明顯促進(jìn)種子萌發(fā)。將 4 種因素復(fù)配成 144 個組合對不同品種烤煙的新陳兩類種子進(jìn)行催芽處理,通過種子萌發(fā)率和生理生化指標(biāo)評價,找到了兩種優(yōu)異配方,其中對 K326和 NC89 種子進(jìn)行催芽的最佳配方分別是 B 和 A。二者的唯一差別是 6-BA 的濃度不同,而單獨(dú)使用0.2、2 mg/L 6-BA 對種子萌發(fā)的促進(jìn)作用沒有顯著差異,故推測這兩種催芽配方對種子萌發(fā)的促進(jìn)作用沒有顯著差異,說明二者在兩個供試品種中具有通用性。然而該配方是否適用于其他品種以及經(jīng)過配方催芽處理后種子所育煙苗移栽大田后的煙株長勢、煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量等方面的情況,需要進(jìn)一步研究。

搭配組合催芽處理明顯優(yōu)于各成分單獨(dú)使用時的效果。煙草種子經(jīng)配方處理后,萌發(fā)迅速且發(fā)芽率高,主根長度明顯增加,一二級側(cè)根數(shù)目增加,幼苗生長健壯,避免了單獨(dú)GA3處理出現(xiàn)的高腳苗問題。催芽種所育煙苗葉綠素含量增加,具有較強(qiáng)的光合作用；根系活力明顯提高,根系發(fā)達(dá),有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和干物質(zhì)的積累[17]；過氧化物酶活性提高,幼苗抗病性和抗逆性好[18]；硝酸還原酶活性提高,說明幼苗N代謝旺盛；裸種浸提液電導(dǎo)率大幅度降低,說明催芽處理后種子細(xì)胞膜完整性得到修復(fù)、活力提高[19]。

WRKY2 轉(zhuǎn)錄因子在植物生理代謝、形態(tài)建成和耐逆抗病等多種信號途徑中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Jiang 等[20]發(fā)現(xiàn),WRKY2 參與調(diào)控 ABA 依賴的種子萌發(fā)和萌發(fā)后的生長抑制。但其在煙草種子萌發(fā)中是否發(fā)揮作用,還未見相關(guān)報道。實(shí)驗(yàn)中通過熒光定量表達(dá)分析證實(shí)催芽處理能夠顯著提高烤煙種子 WRKY2 基因的表達(dá)量。催芽處理的目的是解除種子休眠和促進(jìn)萌發(fā),故推測 WRKY2 可能與煙草種子萌發(fā)有關(guān),其可能通過促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而在一定程度上對種子尤其是陳種子的萌發(fā)能力進(jìn)行修復(fù),從而解除休眠、促進(jìn)萌發(fā)或萌發(fā)后的生長發(fā)育。因此,本研究結(jié)果可實(shí)驗(yàn)用于珍貴煙草陳種子的催芽,對其萌發(fā)能力進(jìn)行修復(fù),提高其發(fā)芽率。

4 結(jié) 論

篩選到兩個優(yōu)異生長物質(zhì)復(fù)配配方 A:1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA 和B:1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA,催芽效果顯著且在不同品種具有通用性；檢測到 WRKY2 基因在催芽后的表達(dá)量顯著提高,推測其與萌發(fā)能力的修復(fù)相關(guān)。

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Effects of Several Growth Substance Combination Treatment on Priming of Flue-cured Tobacco Seeds

QU Xu1,2, DING Anming2, LIU Shaoyun1,2, LV Guoxin3, WANG Yongli3, XU Yongxing3, LI Yijun1,2*
(1. Qingdao Tobacco Seed Co., Ltd., Qingdao 266101, China; 2. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 3. Tobacco Company of Qingdao, Qingdao 266101, China)

s: To improve the quality of primed tobacco seeds, especially the germination ability of old seeds, studies were conducted on the seeds of K326 and NC89 of different years. The seeds were primed by different concentration of MS medium, GA3, IBA and 6-BA, and then the germination rate, physiological and biochemical indices and the expression of germination related gene were detected. The results showed that after priming treatment by proper concentration of each factor, the germination rate of flue-cured tobacco seeds were promoted, and the combination of different growth regulators (1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA and 1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA) had the best effects, After treatment of which the seeds geminated rapidly and each physiological and biochemical index was better than control significantly. What’s more, the expression level of WRKY2 was enhanced remarkably after priming treatment.

flue-cured tobacco; growth substances; seed germination; physiological and biochemical index

S572.041

1007-5119(2014)02-0020-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.02.004

屈 旭,男,碩士研究生,主要從事煙草種子生物學(xué)研究。E-mail:quxu1986@163.com。*通信作者,E-mail:zyseedli@tom.com

2013-07-24

2014-02-16