1.西北民族大學(xué)化工學(xué)院,甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730070

Abstract:ObjectiveTo establish a HPLC method for the Determination of Flavonoids in Tibetan medicine Shibawei Dujuan pills.MethodsThe HPLC analysis was carried out on Kromasil C18(250mm × 4.6mm，5μm)with a mixture of methanol -0.1% phosphate (50∶50)as the mobile phase. The determination wavelength was set at 360nm with the flow rate of 1.0mL·min-1.ResultsThe hyperosid,quercetin, kaempferol and isorhamntin showed good linearity in the range of 0.0773～0.773μg、0.0467～0.467μg、0.0428～0.428μg and 0.0536～0.536μg respectively.The average recovery rate of hyperosid, quercetin and isorhamntin were 98.76%(RSD=1.71%)、97.57%(RSD=1.16) and 97.74%(RSD=1.26)respectively.ConclusionsThe method is stable and accurate.It can be used for the content determination of flavonoids in tibetan medicine shibawei dujuan pills.

Keywords:Shibawei Dujuan Pills;Flos Rhododendri Anthopgonoidi;HPLC

藏藥十八味杜鵑丸由烈香杜鵑、草果、紅花等十八味藥制成，具有疏風(fēng)通絡(luò)，活血的功效，用于治療“血脈病”引起的四肢麻木，肌肉萎縮，筋腱拘攣，口眼歪斜等癥。原標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥第一冊(cè)》，標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)。烈香杜鵑為方中君藥，為杜鵑花科植物烈香杜鵑(RhododendronanthopogonoidesMaxim.)毛喉杜鵑(RhododendroncephalanthumFranch.)及報(bào)春花狀杜鵑(RhododendronprimulaeflarumBur.EtFranch.)的干燥花和葉，歷史上藏醫(yī)也有以帶葉嫩枝作為藥用部位[1]。烈香杜鵑中含有豐富的黃酮類化合物，其中槲皮素、異鼠李素、金絲桃苷、山奈酚等均具有很好的抗氧化活性，在治療心血管系統(tǒng)疾病方面有廣泛應(yīng)用[2]，這與十八味杜鵑丸的功能主治相一致。本文采用高效液相色譜法建立了同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定十八味杜鵑丸中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚及異鼠李素含量的方法，并比較了不同廠家不同批號(hào)幾種成份的差異，為進(jìn)一步控制該制劑質(zhì)量提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司)；梅特勒XS205DU電子天平(瑞士Mettler toledo公司)；B3200S-T型超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司)；MILLI Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試藥 金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)：111521-200303)、槲皮素(批號(hào)100081-200406)、山柰酚(批號(hào)：110861-2004050)、異鼠李素(批號(hào)110860-200407)由中國(guó)藥品生物制品檢定院提供。十八味杜鵑丸( 批號(hào)：090502、111109、110907，寧夏多維藥業(yè)有限公司；批號(hào)：08097A、10231A、09305A，西藏自治區(qū)藏藥廠)。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(4.0mm×250mm，5.0μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液(50∶50)；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1ml中含77.26μg、46.7μg、42.8μg、53.6μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品細(xì)粉約5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲處理40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 依《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥第一冊(cè)》十八味杜鵑丸項(xiàng)下方法，取1 /10 處方量，按制備工藝配制不含烈香杜鵑的陰性供試品，再按照供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液，即得。

2.5 方法學(xué)研究

2.5.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明陰性對(duì)照溶液在各對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置處無(wú)雜質(zhì)峰干擾。供試品色譜圖中金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素與其他組分分離度均大于1.5，分離良好，理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)為8620，符合2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄的有關(guān)要求。

2.5.2 線性關(guān)系 取金絲桃苷對(duì)照品溶液(77.26μg/ml)、槲皮素對(duì)照品溶液(濃度46.7μg/ml)、山柰酚對(duì)照品溶液(濃度42.8μg/ml)、異鼠李素對(duì)照品溶液(濃度53.6μg/ml)，分別精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μl，注入液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 工作曲線考察結(jié)果

2.5.3 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取金絲桃苷對(duì)照品溶液、槲皮素對(duì)照品溶液、山柰酚對(duì)照品溶液、異鼠李素對(duì)照品溶液各5.0μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定金絲桃苷，槲皮素、山柰酚、異鼠李素峰面積，峰面積的RSD分別為0.52%、0.95%、1.26%、1.18%。表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，測(cè)定金絲桃苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素峰面積，結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為1.47%、1.51%、1.42%和1.73%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：090502，寧夏多維藥業(yè)有限公司)6份，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均含量，結(jié)果金絲桃苷為0.23mg/g，RSD為2.10%；槲皮素為0.18mg/g，RSD為1.45%；山柰酚為0.01mg/g，RSD為1.70%；異鼠李素為0.10mg/g，RSD為1.81%。表明方法重現(xiàn)性好，符合定量標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：090502，寧夏多維藥業(yè)有限公司)6份，分別加入金絲桃苷、槲皮素及異鼠李素各適量，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理并測(cè)定，計(jì)算各成分平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2，表明本方法準(zhǔn)確可靠。

2.5.7 樣品測(cè)定 按“2.3”項(xiàng)下方法，對(duì)2個(gè)廠家6批樣品依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

含量測(cè)定結(jié)果表明，寧夏多維藥業(yè)有限公司和西藏自治區(qū)藏藥廠六批樣品中金絲桃苷、槲皮素的含量較高，山柰酚的含量較低，但六批樣品之間差別不明顯。而異鼠李素的含量?jī)杉宜帍S差別較大，其原因可能是烈香杜鵑的用藥部位習(xí)慣不同造成。部頒藏藥標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，烈香杜鵑用藥部位為花和葉，但藏區(qū)有以帶葉嫩枝入藥的習(xí)慣，據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)導(dǎo)，烈香杜鵑的花葉中不含異鼠李素。由此可見(jiàn)，分析十八味杜鵑丸中黃酮類成分的含量對(duì)控制藥品內(nèi)在質(zhì)量很有必要。

樣品中山柰酚的含量較低，經(jīng)計(jì)算在方法學(xué)線性范圍之外，所以未做山柰酚的回收率測(cè)定，山奈素可作為定性檢測(cè)指標(biāo)，含量數(shù)據(jù)僅供參考。

[1]羅達(dá)尚.中國(guó)藏藥(第一卷)[M].上海：上海科技出版社，1996：237.

[2]張娟紅，王榮，賈正平，等．藏藥烈香杜鵑研究概況[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19(8)： 104.

[3]牛迎鳳，邵赟，梅麗娟，等．液相測(cè)定烈香杜鵑葉總黃酮的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(24)：11339.