霍彤，孫寶國，王昌濤，*，孫嘯濤，周雪

（1.北京工商大學(xué)北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京100048）

表面活性劑輔助萃取雪靈芝黃酮及結(jié)構(gòu)初析

霍彤1，孫寶國2，*，王昌濤1，*，孫嘯濤2，周雪1

（1.北京工商大學(xué)北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京100048）

利用正交試驗(yàn)法對(duì)雪靈芝中黃酮類質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)提取樣品的成分進(jìn)行了初步分析。通過單因素試驗(yàn)分別考察表面活性劑種類、表面活性劑用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、回流溫度、回流時(shí)間對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響，選取適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)因素與水平，利用正交法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)各個(gè)因素的顯著性和交互作用進(jìn)行分析。結(jié)果表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%，十二烷基苯磺酸鈉濃度0.25%，料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間30min，提取溫度70℃，此條件下黃酮提取率可達(dá)1.75%，樣品經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含有少量槲皮素和山奈酚，表面活性劑輔助浸提法在植物資源提取領(lǐng)域顯示出了優(yōu)良的應(yīng)用前景。

雪靈芝；提取；十二烷基苯磺酸鈉；正交試驗(yàn)；高效液相色譜

雪靈芝（Arenaria kansuensis Maxim.）又名草靈芝，屬石竹科（Caryophyllaceae）蚤綴屬（Arenaria）植物，分布于海拔5 000m左右的甘肅、青海、四川西部及西藏地區(qū)[1-2]，是生長海拔最高的綠色開花植物之一。研究發(fā)現(xiàn)雪靈芝含有黃酮類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)[3-4]、抗腫瘤[5]、抗自由基活性[6]等多種功效。黃酮類化合物是指以2-苯基苯并吡喃酮為母核，即以C6-C3-C6為骨架結(jié)構(gòu)的一大類天然化合物及其衍生物[7-8]，極性相對(duì)較小，一般為植物體多酚類代謝物。對(duì)植物體內(nèi)黃酮類物質(zhì)提取研究的報(bào)道很多，常用的提取方法包括：加熱水浴回流法[9]、超聲提取法[10]、微波提取法[11]、索式提取法[12]、閃式提取法[13]和超臨界流體萃取法[14]等。但上述提取法一方面提取率較低；另一方面，在提取過程中均需使用濃度較高的有機(jī)試劑，對(duì)環(huán)境污染較大。表面活性劑能夠顯著降低表面張力，提高弱極性物質(zhì)的溶解性，已有文獻(xiàn)報(bào)道將其應(yīng)用于植物資源提取領(lǐng)域[15-17]。

目前，對(duì)雪靈芝黃酮提取的深入研究報(bào)道還較少，本研究在已有工作基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[18]，應(yīng)用表面活性劑輔助浸提法對(duì)雪靈芝黃酮的提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以達(dá)到保障提取率和減少有機(jī)溶劑消耗的目的，屬于綠色化學(xué)范疇；高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）具有高速、高效、高靈敏度的特點(diǎn)，本研究應(yīng)用HPLC對(duì)提取物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪靈芝：市購，產(chǎn)地西藏喜馬拉雅山脈，特級(jí)品。

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等（均為分析純）北京化學(xué)試劑廠；蘆丁對(duì)照品（純度≥98%，生產(chǎn)批號(hào)100080-200707）中國藥品生物制品檢定所；十二烷基苯磺酸鈉（LAS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基三甲基氯化銨（DTAC）、十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）、聚氧乙烯月桂醚（Brij-35）、吐溫20（Tween 20）、曲拉通X-100（X-100）、雙（2-乙己基）磺基丁二酸鈉（Aerosol OT）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-T6型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；RE-52CS/5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TB-2002電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ZN-04B小型粉碎機(jī)：北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；1525高效液相色譜儀（配2707自動(dòng)進(jìn)樣器、2489紫外檢測(cè)器）：美國Waters科技有限公司。

1.3 雪靈芝黃酮的提取方法

取干燥雪靈芝，粉碎過60目篩，準(zhǔn)確稱量2.00 g，按一定比例加入表面活性劑，按一定料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，在一定溫度下回流提取，待提取液冷卻至室溫后減壓抽濾，按1∶1比例加入無水乙醇（因?yàn)樘崛∫河袡C(jī)溶劑濃度較低，提取工程可將蛋白質(zhì)和多糖一并萃取，因此加入無水乙醇將雜質(zhì)沉淀），混勻后靜置60min，15 000 r/min離心10min，取上清液用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容為25mL，混勻后測(cè)定總黃酮含量。

1.4 總黃酮含量的測(cè)定方法

雪靈芝總黃酮含量測(cè)定應(yīng)用鋁絡(luò)合物顯色法。

1.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置采取本課題組之前建立的方法。具體過程為：精確稱取120℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50.3mg，無水乙醇定容至50mL，超聲，得到質(zhì)量濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL容量瓶中，各加入5 g/100mLNaNO2溶液0.8mL，搖勻，靜置6min；加入10 g/100mL Al（NO3）3溶液0.8mL，搖勻，靜置6min；加入1mol/LNaOH溶液10.00mL，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液定容至25.00mL，搖勻，靜置10min～15min，于510 nm波長處測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=1.724 9x+0.010 5，R2=0.999 7。

1.4.2 雪靈芝中總黃酮含量的測(cè)定

精確移取樣品溶液1.00mL于25mL容量瓶中，按照1.4.1節(jié)方法測(cè)定吸光度。

1.4.3 黃酮提取率的計(jì)算公式

式中：Y1為總黃酮提取率，（mg/g）；C1為吸光度按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出得顯色溶液中得質(zhì)量濃度，（mg/ mL）；V1為顯色時(shí)溶液的定容體積，mL；V2為顯色時(shí)移取的提取液的體積，mL；V為提取液的總體積，mL；m為稱取樣品的質(zhì)量，g。

1.5 單因素試驗(yàn)

依1.3實(shí)驗(yàn)方法分別考察表面活性劑種類、表面活性劑用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、回流溫度、回流時(shí)間對(duì)雪靈芝總黃酮提取率的影響。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以影響雪靈芝黃酮提取率的主要因素作為考察因素，采用正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢?yōu)化和預(yù)測(cè)雪靈芝黃酮化合物的提取工藝。

1.7 高效液相色譜法對(duì)雪靈芝黃酮純度的測(cè)定

色譜檢測(cè)條件：Waters Ultimate XB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（含0.05%乙酸），流速1mL/min，進(jìn)樣體積15μL，等度洗脫：乙腈：水（含0.05%乙酸）=55∶45。運(yùn)行時(shí)間：45min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：375 nm。

精確稱取槲皮素、蘆丁和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1mg/mL的三種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液。各吸取0.5mL混勻置于樣品瓶中，再加入0.5mL甲醇，混勻，即得到0.5mg/mL黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣分析。

實(shí)際提取樣品過0.45μm濾膜后直接進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響

由于黃酮極性較弱，水溶液中溶解性較差，因此，升高乙醇濃度勢(shì)必會(huì)提高黃酮得率，但本研究引入表面活性劑的初衷即為減少有機(jī)溶劑的消耗量，并非單純?yōu)榱颂崛÷?，本研究將乙醇濃度選定為5%。

2.1.2 表面活性劑種類對(duì)黃酮提取率的影響

表面活性劑的種類對(duì)提取效果的影響差異較大，分別選擇了毒性較低的：十二烷基苯磺酸鈉（LAS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基三甲基氯化銨（DTAC）、十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）、聚氧乙烯月桂醚（Brij-35）、吐溫20（Tween 20）、曲拉通X-100（X-100）、雙（2-乙己基）磺基丁二酸鈉（Aerosol OT）等八種表面活性劑，考察了在純水和5%乙醇兩種提取介質(zhì)中對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響。表面活性劑種類對(duì)黃酮提取率的影響見圖1。

圖1表面活性劑種類對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of types of surfactant on the extraction of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

圖1 結(jié)果顯示單純使用表面活性劑輔助純水浸提提取率均小于0.5%，提取效率很低；當(dāng)使用5%乙醇作為提取液時(shí)LAS顯示出較高的提取率接近1.6%遠(yuǎn)高于其它7種表面活性劑，因此，本研究選用LAS作為潛在高效表面活性劑進(jìn)行系統(tǒng)研究。

2.1.3 不同表面活性劑濃度提取率的影響

選取十二烷基苯磺酸鈉的添加量在0.06%～0.25%的范圍作為考察對(duì)象，不同表面活性劑濃度對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 表面活性劑的濃度對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of concentration of surfactant on the extraction of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

如圖2所示，雪靈芝黃酮提取率隨著十二烷基苯磺酸鈉的添加量在0.06%～0.25%范圍內(nèi)增加而升高，當(dāng)十二烷基苯磺酸鈉濃度為0.25%時(shí)提取率最高，原因是黃酮類化合物極性較小，因此，隨著十二烷基苯磺酸鈉的添加量增加溶解度增大，提取率升高；當(dāng)十二烷基苯磺酸鈉添加量繼續(xù)增加時(shí)提取率驟然增大，原因可能是高十二烷基苯磺酸鈉添加量使得一些蛋白質(zhì)溶出量增加，參與顯色反應(yīng)使干擾因素增大進(jìn)而影響最終的測(cè)定，導(dǎo)致黃酮類化合物的驟然增大。

2.1.4 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

考察不同料液比（g/mL），即1∶20、1∶30、1∶40和1∶50對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on the extraction of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

如圖3所示，隨著料液比的增大黃酮提取率隨之升高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶40后，繼續(xù)增大料液比提取率反而下降，原因可能是高乙醇體積使得一些醇溶性雜質(zhì)溶出量增加從而與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)，并參與顯色反應(yīng)使干擾因素增大進(jìn)而影響最終的測(cè)定，導(dǎo)致黃酮類化合物的提取率下降。從減少試劑用量和保證提取效率的綜合考慮，最優(yōu)的料液比為1∶40（g/mL）。

2.1.5 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

考察不同溫度對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction yield of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%、LAS添加量為0.12%、料液比為1∶40、提取時(shí)間為1 h的條件下，不同提取溫度對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響如圖4所示，在40℃～90℃的溫度范圍內(nèi)，提取率隨提取溫度的升高而增大，原因可能是溫度的增加能夠降低提取溶劑的黏度，促進(jìn)介質(zhì)傳遞同時(shí)增加溶解度；當(dāng)溫度高于70℃后進(jìn)一步升高溫度，提取率略微降低。從整體趨勢(shì)走向可以看出，提取率的變化范圍比較小，從降低提取成本和保證提取率的綜合因素考慮，最優(yōu)提取溫度為70℃。2.1.6提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

考察不同的提取時(shí)間對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction yield of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%、AR添加量為0.12%、料液比為1∶30、提取溫度為70℃的條件下，不同提取時(shí)間對(duì)雪靈芝黃酮提取率的影響如圖5所示，隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮提取率在1.06%～1.10%范圍內(nèi)波動(dòng)，波動(dòng)范圍較小，因此確定該單因素為不影響因素。從減少提取時(shí)間和保證提取率的綜合因素考慮，最優(yōu)提取時(shí)間為0.5 h。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化雪靈芝黃酮提取工藝及確認(rèn)

2.2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化雪靈芝黃酮提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇表面活性劑濃度、料液比、提取溫度三個(gè)單因素設(shè)計(jì)三因素兩水平的正交試驗(yàn)，主體間因子設(shè)計(jì)見表1。

按照主體間因子設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果分析見表2、表3。

表1 主體間因子表Table1 Between-subjects factors table

表2 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)表Table2 Between-subjects effects test table

表3 估算邊界均值檢驗(yàn)表Table3 Estimating border means test table

由表2分析可知，各因素水平對(duì)結(jié)果影響的強(qiáng)弱順序是：表活濃度＞提取溫度＞料液比，其中表活濃度對(duì)提取率影響最大，提取溫度和料液比對(duì)提取率影響非常小，但是三種單因素對(duì)提取率的影響均為不顯著；由表3分析可知，各因素水平對(duì)提取率的影響結(jié)果為：A2＞A1，B1=B2，C1＞C2。因此最佳工藝選取5%乙醇作為提取劑，表活濃度0.25%，料液比為1∶30，提取時(shí)間30min，提取溫度70℃。

2.2.2 雪靈芝黃酮最佳提取工藝的確證

在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)得出雪靈芝黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%，LAS濃度0.25%，料液比為1∶30，提取時(shí)間30min，提取溫度70℃。在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，平行測(cè)定6批樣品，提取率分別為1.747%，1.743%，1.734%，1.757%，1.762%，1.749%，波動(dòng)范圍很小，故本最佳工藝條件合理，同時(shí)也表明此工藝具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 HPLC法對(duì)提取物的結(jié)構(gòu)分析

圖6所示為標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁，槲皮素和山奈酚的色譜圖，對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間分別為15.4min，33.4min和34.9min。通過HPLC法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品分析的色譜圖結(jié)果見圖6。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.6 The chromatogram of standards

HPLC法對(duì)雪靈芝提取物的分析結(jié)果見圖7。

圖7 實(shí)際樣品的HPLC色譜圖Fig.7 The chromatogram of real sample

將實(shí)際經(jīng)提取獲得的黃酮類物質(zhì)依1.7方法直接進(jìn)HPLC分析，結(jié)果如圖7所示，編號(hào)為1、2色譜峰的保留時(shí)間分別為33.6和34.8min，與標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素和山奈酚的色譜峰相對(duì)應(yīng)，即提取得到的黃酮類物質(zhì)中含有槲皮素和山奈酚，同時(shí)由吸光度數(shù)據(jù)可以看到含量較低。

3 結(jié)論

本研究首先通過單因素試驗(yàn)分別考察表面活性劑種類、表面活性劑用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、回流溫度、回流時(shí)間對(duì)雪靈芝總黃酮提取率的影響，確定了影響黃酮提取率的主要因素，在此基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)得到了最優(yōu)提取工藝條件，并進(jìn)實(shí)驗(yàn)行驗(yàn)證，雪靈芝黃酮的最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%，LAS濃度0.25%，料液比為1∶30，提取時(shí)間30min，提取溫度70℃，此條件下黃酮提取率可達(dá)1.75%，樣品經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含有少量槲皮素和山奈酚，表面活性劑輔助浸提法在植物資源提取領(lǐng)域顯示出了優(yōu)良的應(yīng)用前景。

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Study on Surfactant-assisted Extraction Process and Preliminary Structural Analysis of Total Flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim

HUO Tong1，SUN Bao-guo2，*，WANG Chang-tao1，*，SUN Xiao-tao2，ZHOU Xue1
（1.Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，Beijing Technology&Business University，Beijing 100048，China；2.School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology& Business University，Beijing 100048，China）

The optimum conditions for the extraction of flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim were determined using orthogonal experiment.An analysis method with high performance liquid chromatography（HPLC）was established to study the composition of extraction.On the basis of single-factor experiments，the effect on extraction yield was investigated by surfactant kind，surfactant amount，ethanol concentration，extraction duration，extraction temperature and liquid-to-solid ratio.Based on this，the significance of the various factors and interactions were analyzed with the use of orthogonal experiment.The optimal extraction conditions for flavonoids from Arenaria kansuensis Maxim were ethanol concentration of 5%，sodium dodecylbenzene sulfonate（LAS）concentration of0.25%，liquid-to-solid ratio of1∶30（g/mL），extraction temperature of 70℃ and extraction time of 0.5 h.Under the optimized conditions，the maximum extraction yield of flavonoids was 1.75%.The extraction had a small amount of quercetin and kaempferol which was analyzed by HPLC.Therefore，the extraction method that surfactant-assisted showed good application prospects in the field of extraction effective components of plant.

Arenaria kansuensis Maxim.；extraction；dodecylbenzene sulfonate；orthogonal experiment；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.005

2014-03-19

北京市科技新星項(xiàng)目（2008B08）；“中青年骨干人才培養(yǎng)計(jì)劃”項(xiàng)目（PHR20110873）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201010023）

霍彤（1987—），女（漢），研究生，碩士，研究方向：化妝品生物技術(shù)。

*通信作者：孫寶國（1961—），男，教授，博士，研究方向：食品科學(xué)。王昌濤（1975—），男，副教授，博士，研究方向：生物技術(shù)。