于翠芳，朱英蓮，王世清

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

復(fù)合酶法提取枸杞多糖工藝

于翠芳，朱英蓮*，王世清

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

利用復(fù)合酶的酶解作用對(duì)枸杞多糖的提取工藝進(jìn)行研究。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法分析了酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量對(duì)枸杞多糖的提取率的影響。結(jié)果表明復(fù)合酶法提取枸杞多糖的最佳條件為：加酶量0.32％、酶解溫度51℃、提取時(shí)間60min。在該條件下枸杞多糖的實(shí)際提取率為13.96％，與預(yù)測(cè)值14.10％無(wú)顯著性差異，所得回歸方程能較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該方法與單一酶法相比較，具有提取速度快的優(yōu)點(diǎn)。

纖維素酶；枸杞多糖；響應(yīng)面法

枸杞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，既是食品，又是藥品[1]。枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分之一，不少研究報(bào)道，枸杞多糖具有增強(qiáng)免疫力、防衰老、增強(qiáng)造血功能、防止遺傳損傷、抗癌、抑制腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞突變等作用[2-3]。枸杞多糖對(duì)高血脂患者的血脂有明顯的影響，能顯著降低血清膽固醇及三酞甘油的含量[4-5]。還有研究證明枸杞多糖具有抗氧化功能[6-7]。因此，提取枸杞多糖、提高枸杞多糖的提取率對(duì)開(kāi)發(fā)枸杞資源具有重要意義。研究表明，多糖的有效提取方法很多，酶提取法可以降低提取條件，在比較溫和的條件下加速有效成分的提取[8]。本文主要利用復(fù)合酶在溫和的條件下提取枸杞中的多糖成分，研究影響多糖提取率的主要因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化枸杞多糖的提取工藝，為多糖生產(chǎn)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞（煙臺(tái)產(chǎn)，購(gòu)買(mǎi)于大潤(rùn)發(fā)超市）、纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶（湖州禮來(lái)生物技術(shù)有限公司）、無(wú)水乙醇（分析純）、濃硫酸（分析純）、苯酚（分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平：多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多提取率的計(jì)算[9]

多糖含量的測(cè)定采用硫酸-苯酚法[10]多提取率=多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100％

1.3.2 枸杞多糖的提取步驟

精確稱取一定量的復(fù)合酶（蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶=1∶1∶1）[9]，按重量比1∶10加入蒸餾水，蒸餾水浸沒(méi)酶，置于水浴鍋里40℃條件下活化30min。將枸杞于干燥箱中烘干至恒重將其粉碎。稱取枸杞粉末10 g，加入復(fù)合酶，調(diào)節(jié)溶液的pH，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中浸提后，升溫至90℃，滅酶30min。冷卻至室溫，抽濾，靜置，取上清液，即得到多糖清液。減壓濃縮，加入無(wú)水乙醇沉淀，沉淀用95％乙醇、丙酮、蒸餾水反復(fù)洗滌，干燥得多糖粗樣品，并用分析天平稱量。

1.3.3 纖維素酶法提取枸杞多糖的單因素試驗(yàn)

為確定取枸杞多糖的最佳提取工藝，分別進(jìn)行酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量對(duì)多糖得率的影響試驗(yàn)，應(yīng)用SPSS Statistics17.0分析。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以提取溫度A、加酶量B、提取時(shí)間C作為自變量因子，進(jìn)行3因素3水平的Box-Dehnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度對(duì)枸杞多糖提取率的影響

加水量為100mL，pH=4.5時(shí)，分別在浸提溫度40、45、50、55、60℃下提取1.5 h，所得酶解溫度對(duì)枸杞多糖提取率的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different temperature on the extraction rate of LBP

由圖1可看出，隨著酶解溫度的升高，枸杞多糖提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，提取率達(dá)到最高，此后繼續(xù)升高溫度，提取率又下降。這是因?yàn)槔w維素酶的最佳反應(yīng)溫度為50℃，高于這個(gè)溫度，酶的活性就失活，因而提取率有所下降。

2.2 提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖提取率的影響

加水量為100mL，pH=4.5，酶解溫度為50℃時(shí)，分別在時(shí)間為50、55、60、65、70min條件下提取多糖，所得提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖提取率的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effects of different extraction time on the extraction rate of LBP

由圖2可看出，隨著提取時(shí)間的增加，枸杞多糖提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)將提取時(shí)間控制在60min時(shí)，提取率達(dá)到最高，此后繼續(xù)酶解提取，提取率又下降。

2.3 加酶量對(duì)枸杞多糖提取率的影響

加水量為100mL，pH=4.5，酶解溫度為50℃，提取時(shí)間為60min時(shí)，分別控制加酶量為0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％，在此條件下提取多糖，所得加酶量對(duì)枸杞多糖提取率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 加酶量對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effects of different the amount of enzymes on the extraction rate of LBP

由圖3可看出，隨著加酶量的增加，枸杞多糖提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)將加酶量控制在3％時(shí)，提取率達(dá)到最高，此后繼續(xù)增加加酶量，提取率又下降，可能是因?yàn)楫?dāng)加酶量達(dá)到3％時(shí)，反應(yīng)物已經(jīng)達(dá)到飽和。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

為優(yōu)化工藝工藝參數(shù)，采用響應(yīng)面優(yōu)化分析，表2中列出了17個(gè)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案及枸杞多糖的提取率。

采用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到相應(yīng)的響應(yīng)面回歸方程如下：

枸杞多糖提取率（％）=13.78+0.74A-0.26B+1.55C+ 0.42AB-1.10AC+0.60BC-1.73A2-1.88B2-1.95C2

并對(duì)此模型進(jìn)行方差分析和顯著性測(cè)驗(yàn)，如表3所示。

表2 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案Table2 Box-Behnken experiments design of these experiments

表3 回歸模型模型系數(shù)的顯著性及方差分析Table3 Significance of coefficients for the model and analysis of variance（ANOVA）for model

由表3可以看出，各因素中提取溫度A及其二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響達(dá)到顯著性的水平，加酶量C達(dá)到極顯著性的水平，其二次項(xiàng)達(dá)到顯著水平。提取時(shí)間B對(duì)響應(yīng)值的影響雖然不顯著，但其二次項(xiàng)影響顯著。因此各具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由表4還可以看出模型顯著性水平的P值為0.000 9，表明該模型的不同處理間存在極顯著差異。殘差代表著試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的差值，故該值越小越好。試驗(yàn)中各因素對(duì)枸杞糖提取率的影響殘差為0.59，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好。相關(guān)系數(shù)R值為0.95，表明擬合度＞90％，所以該模型能夠反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中響應(yīng)值的變化。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

根據(jù)響應(yīng)方程所繪制的響應(yīng)曲面圖如圖4、圖5、圖6所示。他們能直觀的描述兩個(gè)因素之間對(duì)響應(yīng)值的交互作用。

圖4 酶解溫度與時(shí)間的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface of extraction temperature and time

圖5 酶解溫度與加酶量的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of extraction temperature and the amount of enzymes

圖6 酶解時(shí)間與加酶量的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of extraction time and the amount of enzymes

由圖4～圖6可以較直觀的觀察響應(yīng)面曲線圖。由圖4可以看出，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，提取溫度對(duì)枸杞多糖提取率的影響呈拋物線形狀，這說(shuō)明提取時(shí)間一定時(shí)，存在最適合的提取溫度；同時(shí)，在提取溫度一定時(shí)，枸杞多糖提取率隨著提取時(shí)間的變化也呈現(xiàn)出拋物線的形狀。溫度對(duì)響應(yīng)值的影響較大，表現(xiàn)的曲線比較陡峭。由圖5可以看出，在加酶量一定時(shí)，隨著提取溫度的升高，枸杞多糖提取率也隨之升高，但隨著提取溫度的進(jìn)一步升高，溫度變化對(duì)枸杞多糖的提取率不明顯，表現(xiàn)的曲線比較平緩，甚至降低。在提取溫度一定時(shí)，加酶量的變化對(duì)枸杞多糖的提取率影響顯著，表現(xiàn)的曲線非常陡，但隨著加酶量的增加，其曲線也漸趨平緩，說(shuō)明加酶量也存在一個(gè)最高點(diǎn)。由圖6可以看出，在加酶量一定時(shí)，提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖提取率的影響成拋物線狀，進(jìn)一步說(shuō)明提取時(shí)間存在一個(gè)最高點(diǎn)。在提取時(shí)間一定時(shí)，加酶量的變化對(duì)枸杞多糖的提取率影響顯著，表現(xiàn)的曲線較陡。綜合圖4～圖6可以分析出各因素對(duì)枸杞多糖的提取率影響順序?yàn)椋杭用噶浚咎崛囟龋咎崛r(shí)間。利用響應(yīng)面優(yōu)化軟件分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得出最佳酶處理?xiàng)l件為：酶解溫度51℃、提取時(shí)間60min、加酶量0.32％。在此條件下測(cè)得枸杞多糖的提取率為13.96％，在誤差允許的范圍內(nèi)，與模型的預(yù)測(cè)值符合良好。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到相應(yīng)的響應(yīng)面回歸方程如下：

枸杞多糖提取率（％）=13.78+0.74A-0.26B+1.55C+ 0.42AB-1.10AC+0.60BC-1.73A2-1.88B2-1.95C2，相關(guān)系數(shù)R值為0.95，表明擬合度＞90％，所以該方程能夠反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中響應(yīng)值的變化。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，纖維素酶法提取枸杞多糖的最佳工藝條件是酶解溫度51℃、提取時(shí)間60min、加酶量0.32％。在該工藝條件下枸杞多糖的提取率達(dá)13.96％，與預(yù)測(cè)值符合較好。該法提取枸杞多糖，利用了酶的專一性和高效性以及反應(yīng)條件的溫和性，與單一酶法[11]相比，提取率無(wú)顯著性差異，但速度快，速度提高50％。

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Study on Extraction of Lycium Barbarum Polysaccharides by Compound Enzymes Method

YU Cui-fang，ZHU Ying-lian*，WANG Shi-qing
（Deparpartment of Food Science and Engineer，Qingdao Agricultural University，Qingdao266109，Shandong，China）

The extraction process of lycium barbarum polysaccharides was studied in the paper by the use of compound enzymes.Based on the single factor experiment，the extraction effects of enzymolysis temperature，enzymolysis time，enzyme amount were studied through the box-behnken centre design and response surface method（RSM）test.The optimum extraction conditions were as followings：adding 0.32％enzyme at 51℃ for 60 min，the polysaccharides extraction rate reached 13.96％.The value is no marked different from the forecasts. Therefore，the regression equation could better forecast the result of the experiment.Compared with one enzyme method，the method had the advantages of high speed.

cellulose；lycium barbarum polysaccharides；response surface method（RSM）test

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.010

2012-09-23

于翠芳（1962—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者