蘇 堅,潘志兵,史 玲,向姝霖,夏 紅,董 琳,廖愛軍,蘇 琦

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院病理科湖南省胃癌研究中心,湖南衡陽421001;2.南華大學腫瘤研究所湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室;3.南華大學附屬第一醫(yī)院病理科)

結(jié)腸癌是世界上第三位最常見惡性腫瘤,據(jù)最新統(tǒng)計,全球每年新發(fā)病例120余萬和近61萬人死亡,且其發(fā)生率和死亡率有逐漸上升的趨勢[1]。由于臨床上患者就診時大多已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移,治療效果較差。因此,研究結(jié)腸癌遷移侵襲的機制和開發(fā)新一代有效低毒的抑制劑,對結(jié)腸癌的防治有重要意義。

研究證實,LIMK1在腫瘤中高表達,并通過調(diào)控肌動蛋白解聚因子ADF/Cofilin磷酸化與去磷酸化之間的平衡,影響actin細胞骨架結(jié)構(gòu),促進腫瘤細胞侵襲,而RNA干擾LIMK1基因可明顯減少腫瘤細胞遷移侵襲。LIMK1經(jīng)由上游信號分子介導調(diào)控的信號通路中處于中心地位,可能是有價值的靶點[2-4]。然而,有關(guān)LIMK1在人結(jié)腸癌表達以及對細胞遷移和侵襲的影響鮮有報道,本文就此做一研究。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人結(jié)腸癌SW480細胞株由本實驗室保存。培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中(Gibco公司)。在37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng),每2天傳一代。小牛血清(杭州四季青生物工程公司),RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)。Transwell小室(Corning公司),Matrigel(BD公司),Total RNA Kit(Omega公司),RT reagent kit(TaKaRa公司),PCR試劑盒(Promega公司)。BCA蛋白定量檢測試劑盒(Pierce公司),ECL發(fā)光檢測試劑盒和免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),LIMK1(ab39641),Phospho LIMK1(ab131341)和β-actin兔多克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 結(jié)腸癌標本與免疫組化染色

本院手術(shù)切除的結(jié)腸癌標本87例,其中,＜50歲38例,≥50歲49例;腫塊直徑52例≥5 cm,35例＜5 cm;高分化腺癌10例,中分化腺癌47例,低分化腺癌30例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例,無轉(zhuǎn)移42例;Dukes A+B期41例,C+D期46例。SP試劑盒、DAB顯色劑、0.1 mol/L PBS、0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復液、EDTA修復液均購自福州邁新生物技術(shù)公司,按試劑盒說明進行。結(jié)果判定:LIMK1陽性表達為棕黃或棕褐色,定位于胞漿或胞核。根據(jù)陽性細胞染色程度及著色細胞百分率記分:0分不著色,1分淺棕色,2分深棕色;著色細胞＜5%為0分,5% ～25%為1分,26% ～50%為2分,＞50%為3分。兩種分值相加,1分為(-),2分為弱陽性(+),3分為陽性(++);＞4分為強陽性(+++)。

1.3 建立穩(wěn)定低表達LIMK1基因的人結(jié)腸癌SW480細胞

1.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 LIMK1-microRNA重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR由Invitrogen公司構(gòu)建和鑒定(共構(gòu)建了4個,分別為pcDNA6.2/LIMK1-miRNA 1、2、3、4)。 根據(jù)分子克隆提供的操作步驟進行轉(zhuǎn)化細菌,挑選陽性轉(zhuǎn)化細菌,抽提質(zhì)粒,并經(jīng)公司測序鑒定正確后用于實驗。質(zhì)粒的抽提按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進行。

1.3.2 建立穩(wěn)定低表達LIMK1基因的人結(jié)腸癌SW480細胞 取對數(shù)生長期的SW480細胞,調(diào)整細胞至1×105/mL,取0.5 mL接種于24孔板,37℃培養(yǎng)至細胞貼壁覆蓋率達70%～90%時進行轉(zhuǎn)染。無血清培養(yǎng)基清洗細胞2～3次后再換opti-MEM培養(yǎng)基洗2～3次,加 400 μL無血清opti-MEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。加入0.8 μg重組質(zhì)粒(pcDNA6.2/LIMK1-miRNA)于無血清opti-MEM培養(yǎng)基中,設立空載體對照組(Vector),各組終體積為50 μL。將2 μL LipofectamineTM2 000 加入到48 μL 無血清 opti-MEM中并充分混勻,37℃孵育3～5 min。滴入上述混合物于細胞,充分混勻,培養(yǎng)6 h后,更換為10%胎牛opti-MEM培養(yǎng)液。48 h后,以1∶10比例傳代。調(diào)整細胞濃度至10/mL,以100 μL/孔接種于96孔板。24 h后,觀察并在培養(yǎng)板上標注有單個細胞的培養(yǎng)孔。確定最佳殺稻瘟菌素的篩選濃度為4 mg/L。加藥后篩選陽性細胞單克隆,每隔3天換液并加藥,篩選4周后可見有抗性的單克隆出現(xiàn),免疫熒光顯微鏡觀察。將陽性單克隆細胞擴大培養(yǎng),依次轉(zhuǎn)入24、6孔板及培養(yǎng)瓶并凍存細胞。RT-PCR與Western Blot鑒定陽性克隆LIMK1干擾效果。

1.4 劃痕愈合實驗

調(diào)整細胞為1×106/mL,吸1 mL細胞懸液接種于6孔板,加無血清DMEM培養(yǎng)6 h,使細胞呈單層貼壁生長狀態(tài)。用10 μL Eppendorf Tip在細胞板上劃痕,無血清培養(yǎng)液洗3次,加新鮮的無血清培養(yǎng)基。實驗分SW480細胞組、空載體組、LIMK1-miR組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按0、24 h取樣、拍照,用Image-Pro Plus 6.0軟件測量劃痕距離,計算平均值與標準差。細胞遷移率計算:遷移率(%)=(原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度)/原劃痕寬度×100%。實驗重復3次。

1.5 Transwell侵襲實驗

采用孔徑8.0 μm的24孔Transwell小室。實驗分組同上。準備基質(zhì)膠,將凍存于-80℃冰箱的matrigel 4℃過夜,變成液態(tài);無血清培養(yǎng)基以1∶9稀釋,吸50 μL 均勻鋪到Transwell上室,37°C 過夜,當出現(xiàn)“白色層”時,在上室中加入100 μL預溫的無血清的DMEM培養(yǎng)基,孵育30 min,使基質(zhì)膠再水化,吸去剩余培養(yǎng)液,消化細胞,無血清培養(yǎng)基洗3次,調(diào)整細胞為1×106個/mL;取細胞懸液100 μL加入上室,下室加500 μL完全培養(yǎng)基;37℃、5%CO2孵育24 h,棄培養(yǎng)基,擦拭上室細胞;取出transwell用PBS洗2次,4%多聚甲醛固定細胞10 min,倒置,風干;加0.1%結(jié)晶紫染色20 min,PBS洗3次,擦凈上室細胞;倒置顯微鏡下隨機計數(shù)10個視野的細胞,取均數(shù)。每組設3個復孔,實驗重復3次。侵襲抑制率(%)=(對照組穿膜細胞-處理組穿膜細胞)/對照組穿膜細數(shù)×100%。

1.6 RT-PCR

用Total RNA Kit提取組織總RNA,按試劑盒說明書進行操作。在AMV酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。LIMK1及 β-actin引物由上海生工合成。LIMK1:F5′-GGG GCA TCA TCA AGA GCA-3′,R5′-GAG GAC TAG GGT GGT TCA G-3′,擴增長度為138 bp;β-actin:F5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG GG-3′,R5′-ATG ATG GAG TTG AAG GTA GTT TCG TGG AT-3′,擴增長度為367 bp。 LIMK1反應條件:94℃ 5 min;然后94℃ 30 s,52.3℃ 30 s,72℃1 min進行35個循環(huán);72℃ 10 min。β-actin反應條件:94℃ 5 min;然后94℃ 30 s,55.0℃ 30 s,72℃1 min進行35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照,AlphaImager 2200軟件進行掃描,以相對光密度代表基因表達豐度,以LIMK1表達豐度/β-actin表達豐度計算平均光密度值。實驗重復3次。

1.7 Western blot檢測

收集細胞,預冷PBS洗3次,吸盡殘留液后,加入適量體積裂解液(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-Hcl pH7.6,1 mmol/L EDTA pH 8.0,1 μg/mL Aprotinin,100 μg/mL PMSF),冰上裂解 1h,刮下后轉(zhuǎn)移至EP管中,12 000×g 4℃離心30 min,吸取上清液,即為細胞總蛋白。BCA法進行蛋白濃度測定。調(diào)節(jié)樣品濃度,以每孔30 μg蛋白加樣,加入等體積2×SDS加樣緩沖液,煮沸5 min,SDS-PAGE膠電泳;電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上;脫脂牛奶封閉PVDF膜1 h;加一抗4℃孵育過夜,TBST洗3次,每次15 min;羊抗兔Ⅱ抗,37°C孵育1 h,TBST洗3次,每次15 min;用ECL發(fā)光法檢測蛋白表達狀況,圖像分析軟件AlphaImager 2 200測定印跡區(qū)帶的光密度。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件One-Way Anova或t檢驗進行統(tǒng)計學處理,不同組間的比較采用χ2檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 LIMK1蛋白表達與結(jié)腸癌臨床病理的關(guān)系

圖1和表1顯示,LIMK1在結(jié)腸癌組織陽性表達(75.86%)明顯高于結(jié)腸正常組織(P＜0.05);高分化腺癌表達(40.00%)明顯低于中分化(70.21%)與低分化腺癌(96.67%)(P＜0.05),而低分化高于中分化腺癌(P＜0.05);＜50歲與≥50歲患者表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);腫瘤直徑＜5.0 cm的結(jié)腸癌表達(57.14%)明顯低于≥5.0 cm(88.46%)(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(97.78%)顯著高于無轉(zhuǎn)移的(52.38%)(P＜0.05);Dukes分期A+B組表達(60.98%)明顯低于C+D組(89.13%)(P＜0.05)。表明LIMK1表達與患者年齡無關(guān),而與腫瘤發(fā)生、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期有關(guān)。

圖1 LIMK1蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(SP×10)

表1 LIMK1蛋白表達與臨床病理的關(guān)系

2.2 沉默LIMK1基因pcDNA6.2/LIMK1-miRNA/SW480細胞的建立和鑒定

構(gòu)建的LIMK1基因干擾質(zhì)粒(pcDNATM6.2-GW/EmGFP-LIMK1-miRNA1、 miRNA2、 miRNA3、miRNA4)在脂質(zhì)體的介導下轉(zhuǎn)染SW480細胞,可見大量綠色熒光表達,表明LIMK1基因干擾質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染入細胞中(圖2A)。

圖2B所示,各組總RNA可見較明顯的28S、18S帶。 RT-PCR 檢測顯示,LIMK1-miR1、-miR2、-miR3和-miR4各組較未轉(zhuǎn)染組與空載體組LIMK1 mRNA表達明顯下調(diào),而LIMK1-miR1組干擾效率可達90%以上(圖2C)。Western blot檢測也顯示,LIMK1-miR1、-miR2、-miR3和-miR4 各組較未轉(zhuǎn)染組與空載體組 LIMK1蛋白表達顯著降低,且以LIMK1-miR1干擾組效果最明顯,與RT-PCR結(jié)果一致(圖 2D)。因此,選取 LIMK1-miR1作為后續(xù)研究。

圖2 穩(wěn)定低表達LIMK1基因SW480細胞系的建立和鑒定

2.3 沉默LIMK1對SW480細胞LIMK1和p-LIMK1蛋白表達的影響

圖3A顯示,沉默組LIMK1和p-LIMK1蛋白表達較未轉(zhuǎn)染組與空載體組明顯下調(diào)(P＜0.05)。免疫細胞化學檢測證實,沉默組LIMK1蛋白表達較未轉(zhuǎn)染組與空載體組明顯降低(圖3B)。表明沉默LIMK1可明顯下調(diào)SW480細胞LIMK1蛋白表達和抑制LIMK1蛋白磷酸化。

圖3 沉默LIMK1對SW480細胞LIMK1與p-LIMK1蛋白的表達影響

2.4 LIMK1基因沉默對SW480細胞遷移的影響

圖4顯示,對照組、空載體組與LIMK1沉默組在0 h時,劃痕距離分別為 190.90±0.57 μm、195.20 ±0.30 μm 與 195.30 ±0.22 μm,差異無顯著性(P＞0.05)。24 h后,LIMK1沉默組劃痕距離151.1±12.1 μm 較對照組44.6±17.28 μm 與空載體組 54.30±8.38 μm明顯增寬,細胞遷移率(22.53%)較對照組(76.50%)與空載體組(72.14%)明顯降低(P＜0.05)。表明沉默LIMK1基因可抑制SW480細胞遷移能力。

圖4 沉默LIMK1基因?qū)W480細胞遷移的影響(×10)

2.5 LIMK1基因沉默對SW480細胞侵襲的影響

侵襲實驗結(jié)果顯示,沉默LIMK1組穿膜細胞(43.67±1.51個)較未處理組(143.33±1.52個)與空載體組(136.34±1.53個)明顯減少(P＜0.05);未處理組與空載體組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖5)。表明沉默LIMK1基因可抑制SW480細胞侵襲能力。

圖5 沉默LIMK1基因?qū)W480細胞侵襲的影響(×20)

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力,靶向抑制腫瘤細胞遷移侵襲過程的基因為治療腫瘤提供了新思路。大量研究證實,細胞遷移是由細胞偽足啟動的高度整合的多階段過程。遷移和侵襲的細胞形成的偽足結(jié)構(gòu)取決于其形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能特征,這些結(jié)構(gòu)的形成由時空調(diào)控的肌動蛋白聚合作用所驅(qū)動。actin細胞骨架重組是腫瘤細胞遷移、粘附和侵襲的基本,有眾多分子參與了肌動蛋白聚合與解聚的調(diào)節(jié),其中,LIMK基因就是一個重要的分子[5-8]。

LIMK在腫瘤遷移侵襲過程中發(fā)揮重要作用,其通過對ADF/cofilin磷酸化與去磷酸化的平衡進行調(diào)節(jié)而影響肌動蛋白細胞骨架結(jié)構(gòu),促使腫瘤細胞發(fā)生遷移和侵襲。這個過程主要受Rac1-ROCK/PAK-LIMKADF/Cofilin通路調(diào)控,而LIMK位于這一精細調(diào)控信號通路的中心,因此,LIMK可能是開發(fā)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移新的治療藥物的候選靶點[2,5]。LIMK1磷酸化可滅活Cofilin/ADF,RNA干擾LIMK1表達可明顯減少鼠腹水肝細胞癌MM1細胞遷移,提示LIMK1介導cofilin/ADF磷酸化和去磷酸化與腫瘤細胞遷移與侵襲有關(guān)[5]。采用CDK抑制劑p57(kip2)可通過LIMK/cofilin途徑抑制鼻咽癌細胞遷移侵襲,而沉默p57(kip2)則可促進遷移侵襲[9]。LIMK1在乳腺癌MDA-MB-435細胞高表達可促進細胞增殖和侵襲,上調(diào)uPA和uPAR表達,增加裸鼠移植瘤生長,促進腫瘤血管形成,誘導肝、肺轉(zhuǎn)移[10]。沉默LIMK1基因或LIMK1抑制劑可降低cofilin磷酸化,抑制乳腺癌等腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移[3,4,11]。LIMK1高表達可促進耐藥的骨肉瘤MG63/VCR細胞侵襲轉(zhuǎn)移,而沉默LIMK1基因能夠廢除MG63/VCR細胞侵襲能力[12]。Chhavi等[13]發(fā)現(xiàn)宮頸癌LIMK1表達較正常組織與CIN高4.6與3.0倍。LIMK1表達與子宮頸癌侵襲呈明顯正相關(guān),而與生存率呈負相關(guān)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),LIMK1在76%乳腺癌胞漿高表達,同時伴有52%核內(nèi)表達,而正常乳腺組織僅有48%胞漿與27%胞核表達,并且,LIMK1可促進MDA-MB-231細胞侵襲與裸鼠移植瘤腫瘤生長[14]。

本研究顯示,LIMK1在結(jié)腸癌中表達明顯高于結(jié)腸正常組織,高分化腺癌LIMK1表達明顯低于中分化與低分化腺癌,而中分化顯著低于低分化腺癌;直徑＜5.0 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期C+D組結(jié)腸癌LIMK1表達分別明顯高于≥5.0 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和A+B組,表明LIMK1表達與結(jié)腸癌的發(fā)生、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)。并且,沉默LIMK1基因后,發(fā)現(xiàn)LIMK1和p-LIMK1蛋白表達明顯下調(diào),遷移與侵襲能力顯著下降。表明沉默LIMK1基因可明顯抑制SW480細胞遷移和侵襲能力,LIMK1可能是導致結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要分子。

近年來,研究發(fā)現(xiàn)二烯丙基二硫(DADS)具有明顯抑制人結(jié)腸癌細胞增殖的作用[15-17],并可通過阻斷 Rac1-ROCK/PAK-LIMK-ADF/Cofilin信號通路,下調(diào)LIMK1抑制SW480細胞遷移與侵襲[18-19]。上述研究給予一個重要提示,靶向抑制LIMK1的藥物將可能成為治療結(jié)腸癌的新策略。

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