代文婷，陶永霞，楊海燕，白羽嘉，馮作山*

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052)

血紅素廣泛存在于動(dòng)物的血液、肌肉和某些植物組織中，是一類重要的含鐵天然卟啉化合物[1]，在食品、醫(yī)藥、化工、保健品等行業(yè)中有廣泛的用途。在食品工業(yè)中，血紅素可替代發(fā)色劑亞硝酸鹽及人工合成色素加入火腿、灌腸等食品中，所得制品切面色澤均勻、鮮艷美觀，保持肌肉固有的天然色彩，且口感韌性強(qiáng)、味道純正，也降低了亞硝酸鹽對(duì)人體的危害[2,3]；在醫(yī)藥行業(yè)中，血紅素不僅是半合成法制備膽紅素的前體，而且是制備抗癌、抗炎藥物的重要原料[4,5]；人體對(duì)血紅素鐵的吸收率是無(wú)機(jī)鐵的3倍[6]，在臨床醫(yī)學(xué)中，血紅素常用作高效的補(bǔ)鐵劑，可治療因缺鐵引起的貧血癥[7,8]。

對(duì)血紅素的提取已有相關(guān)報(bào)道，多以豬血、牛血、雞血等畜禽血為原料進(jìn)行提取。新疆擁有豐富的馬種資源，但其開(kāi)發(fā)利用深度不夠，未能體現(xiàn)出獨(dú)特的價(jià)值。本研究以馬血為原料，采用超聲波結(jié)合CMC-Na提取血紅素，并選用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法分析試驗(yàn)結(jié)果，最終得到馬血血紅素的最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

新鮮馬血購(gòu)買于新疆瑪納斯縣屠宰場(chǎng)；血紅素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98% ）Sigma公司；檸檬酸三鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、CMC-Na等均為分析純 天津市盛淼精細(xì)化工有限公司。

JY 92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ-2 增力電動(dòng)攪拌器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；FA2104N電子分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；YY3009000型換膜式過(guò)濾器 美國(guó)Millipore公司；XX8200115型蠕動(dòng)泵美國(guó)Millipore公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE20型pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲波結(jié)合CMC-Na提取馬血血紅素

試驗(yàn)在王超英[9]的基礎(chǔ)上，進(jìn)行工藝改進(jìn)，得到提取的工藝流程：新鮮馬血→加入檸檬酸三鈉 (8g/L)抗凝[10]→攪拌→4000r/min離心10min分離RBC→RBC中加入0.9%的生理鹽水離心兩次→加入去離子水溶血，攪拌均勻→超聲波破碎→調(diào)溶液pH值，使之達(dá)到珠蛋白和血紅素分離的最佳值，并連續(xù)攪拌2h→膜分離（流速1.7m/s，壓力 0.05MPa）→調(diào)節(jié)溶液 pH值→加入 CMC-Na(1.2%)懸浮液吸附，連續(xù)攪拌 2h提取血紅素→高速離心，分離出血紅素→洗滌，干燥→血紅素。

1.2.2 血紅素產(chǎn)率計(jì)算公式[11]：

血紅素總含量/g=提取樣品總質(zhì)量×樣品中血紅素純度

式中：m 為稱取樣品的質(zhì)量；V 為血紅素溶液體積，即100mL。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 超聲功率對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲時(shí)間為10min、去離子水的添加量為RBC的5倍、提取pH為5.5、CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察超聲功率分別為195、260、325、390W時(shí)對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響。

1.2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、去離子水的添加量為RBC的5倍、提取pH為5.5、CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察超聲時(shí)間分別為5、10、15、20min時(shí)對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響。

對(duì)于有單獨(dú)公豬舍的豬場(chǎng)，應(yīng)想法使公豬舍的室溫保持在13℃～20℃，或者把公豬放入后備舍或妊娠母豬舍以維持公豬需要的適宜溫度，減輕降溫對(duì)公豬的影響。

1.2.3.3 去離子水的添加量對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、超聲時(shí)間為10min、提取pH為5.5、CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察去離子水的添加量分別為RBC體積的2、3、4、5、6、7倍時(shí)對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響。

1.2.3.4 提取pH對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、超聲時(shí)間為10min、去離子水的添加量為RBC的5倍，CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察提取pH分別為4.5、5、5.5、6時(shí)對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響。

1.2.3.5 CMC-Na的添加量對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、超聲時(shí)間為10min、去離子水的添加量為RBC的5倍，提取pH為5.5的條件下，考察CMC-Na的添加量分別為5、10、15、20、25mL時(shí)對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，優(yōu)化血紅素的提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲功率對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 超聲功率對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響Fig.1 The influence of ultrasonic power on the yield of heme

由圖1可知，超聲功率對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響比較顯著，隨超聲功率的不斷增加，血紅素的產(chǎn)率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率調(diào)至325W時(shí)，血紅素產(chǎn)率達(dá)到最大值；當(dāng)超聲功率大于325W時(shí)，血紅素產(chǎn)率呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)槌暡栈?yīng)雖有助于紅細(xì)胞破碎，但隨其強(qiáng)度增大及超聲還引起一定的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致血紅蛋白變性凝聚[12,13]，致使血紅素的釋放受阻，進(jìn)而影響了血紅素的產(chǎn)率。綜合考慮生產(chǎn)過(guò)程中的各種因素，超聲波功率設(shè)定為325W。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響

超聲時(shí)間對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響Fig.2 The influence of ultrasonic time on the yield of heme

由圖2可知，超聲時(shí)間對(duì)血紅素產(chǎn)率影響較大，隨超聲時(shí)間的增加，血紅素的產(chǎn)率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在10min時(shí)達(dá)到峰值，隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)率開(kāi)始下降。產(chǎn)生此現(xiàn)象可能是因?yàn)槌曔_(dá)到一定值后，空化趨于飽和，再延長(zhǎng)超聲時(shí)間會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用氣泡，降低了空化強(qiáng)度，進(jìn)而影響了血紅素的產(chǎn)率。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)中各種因素，超聲波時(shí)間選擇10min比較適宜。

2.1.3 去離子水的添加量對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響

去離子水的添加量對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 V去離子水/VRBC對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響Fig.3 The influence of deionized water/RBC (v/v) on the yield of heme

由圖3可知，去離子水添加量對(duì)血紅素提取影響較大，產(chǎn)率隨去離子水添加量的增加，呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)去離子水的添加量為RBC的5倍時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最大值，而后開(kāi)始緩慢下降。這種現(xiàn)象可能是隨去離子水的添加，紅細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差逐漸增大，紅細(xì)胞吸水致細(xì)胞膜脹裂，利于其中血紅蛋白的釋放，但達(dá)到峰值后再繼續(xù)增加去離子水的體積，整個(gè)提取液的濃度降低，一定程度上抑制了CMC-Na對(duì)血紅素的吸附。所以綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)中各種因素，選取去離子水的添加量為RBC體積的5倍比較適宜。

2.1.4 提取pH對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響

提取pH對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取pH對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響Fig.4 The influence of extraction pH on the yield of heme

由圖4可知，提取pH對(duì)血紅素產(chǎn)率有一定影響，隨提取pH值的增大，血紅素產(chǎn)率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取液pH為5.5時(shí)達(dá)到峰值。這種現(xiàn)象可能是由于血紅素卟啉對(duì)脂質(zhì)雙分子層有親和作用，當(dāng)pH值在4.0～6.0時(shí)，卟啉與脂質(zhì)雙分子層摻和量最小，此時(shí)卟啉分布率最高，故提取液的pH值選取5.5較適宜。

2.1.5 CMC-Na添加量對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響

CMC-Na添加量對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 CMC-Na添加量對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響Fig.5 The influence of amount of CMC-Na on the yield of heme

由圖知，血紅素產(chǎn)率隨CMC-Na添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)添加量為10mL時(shí)達(dá)到峰值。經(jīng)方差分析，添加量對(duì)血紅素產(chǎn)率沒(méi)有顯著性影響（P>0.05），因此在響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中不再把CMC-Na添加量作為一個(gè)因素考慮。

2.2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)曲面結(jié)果分析

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Trial design and results

利用Design-Expert 8.06軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，建立血紅素產(chǎn)率與以上四個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface test

注：**.P<0.01，差異極顯著；*.P<0.05，差異顯著。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，模型P<0.01，表明回歸模型極顯著；模型的一次項(xiàng)A、B、C均極顯著，D不顯著；二次項(xiàng)均極顯著；交互項(xiàng)BC極顯著，AB、AC、AD、BD和CD均不顯著。以上表明，各因素對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)P=0.4236＞0.05不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9637，說(shuō)明模型擬合程度良好，可用來(lái)分析和預(yù)測(cè)超聲波結(jié)合CMC-Na提取血紅素的結(jié)果。四因素對(duì)血紅素產(chǎn)率的影響順序?yàn)椋撼暪β剩綱去離子水/VRBC＞超聲時(shí)間＞提取pH。

2.2.2 因素間的交互作用

采用Design Expert 8.06軟件分析并繪制響應(yīng)面圖，如圖6-圖11所示。

圖6 超聲功率與超聲時(shí)間對(duì)血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.6 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and ultrasonic time

圖7 超聲功率與去離子水和RBC體積比對(duì)血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.7 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and deionized water/RBC (v/v)

圖8 超聲功率與提取pH對(duì)血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.8 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and extraction pH

圖9 超聲時(shí)間與去離子水和RBC體積比對(duì)血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.9 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic time and deionized water/RBC (v/v)

圖10 超聲時(shí)間與提取pH對(duì)血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.10 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic time andextraction pH

圖11 去離子水和RBC體積比與提取pH對(duì)血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.11 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of deionized water/RBC (v/v) and extraction pH

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)分析，最適條件值為超聲功率336.24W、超聲時(shí)間9.33min、去離子水的添加量是RBC的5.15倍、提取pH5.51，在此條件下血紅素的預(yù)測(cè)產(chǎn)率約為0.42g/50mL。考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝修正：超聲功率為338W、超聲時(shí)間為10min、去離子水的添加量是RBC體積的5倍、提取pH為5.5。采用修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。血紅素產(chǎn)率分別為0.42、0.43、0.41g/50mL，血紅素產(chǎn)率試驗(yàn)均值為0.42g/50mL，與模型預(yù)測(cè)值相差不大，可見(jiàn)該模型可以較好地反映出超聲波結(jié)合CMC-Na提取血紅素的條件。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)Design-Expert軟件，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)超聲波結(jié)合CMC-Na提取馬血中血紅素工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)并優(yōu)化，建立了提取血紅素的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化了提取工藝條件，得出最佳工藝條件：超聲功率為338W、超聲時(shí)間為10min、去離子水的添加量是RBC的5倍、提取pH為5.5時(shí)，血紅素產(chǎn)率達(dá)到最大值0.42 g/50mL，與預(yù)測(cè)值0.42g/50mL基本一致，說(shuō)明響應(yīng)面法適用于對(duì)超聲結(jié)合CMC-Na提取馬血血紅素進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。

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