李銀花，李洪燕

(1.廣東食品藥品職業(yè)學院，廣東廣州510520;2.廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510110)

葛花為豆科葛屬落葉藤本植物的花朵，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，在我國資源豐富，特別是在廣西、云南、四川、福建、臺灣等地已有廣泛種植［1］。葛花富含多種生理活性物質(zhì)，例如黃酮、多糖、氨基酸、微量元素等［2］，它們表現(xiàn)出較多的生理活性，例如影響特異基因表達、保護心血管及抗癌等［3－5］。葛花的開發(fā)研究與綜合利用是目前研究的焦點之一，但是葛花中原花青素產(chǎn)品的提取、開發(fā)、綜合利用等還鮮有報道，同時如何高效的提取葛花中的原花青素也還有待研究。原花青素(procyanidins，PC)是一種具有特殊分子結(jié)構的生物類黃酮，它由黃烷－3－醇和黃烷－3，4－二醇的配位縮合或聚合而成的低聚或多聚物［6］。原花青素由于其特殊、多樣的分子結(jié)構，因此具備抗衰老、抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤、抗菌等多種生理活性及藥理作用［7］。它廣泛存在于自然界中，目前原花青素主要來從葡萄籽、松樹皮中提取，提取原花青素來源單一，無法滿足社會的需要。

傳統(tǒng)的原花青素提取方法主要是水浸提法［8］和有機溶劑提取法［9］等。傳統(tǒng)的提取方法不但提取時間很長，而且提取溫度高，會嚴重影響原花青素組成。酶法提取是一種優(yōu)良的提取方法，它利用相應的酶破壞植物細胞，促進有效物質(zhì)的快速溶出。酶法提取不僅操作簡便迅速，并能在一定的程度上提高提取率，目前已廣泛應用在生物活性物質(zhì)提取方面［10－11］。在研究中采用酶法提高葛花中原花青素的含量及提取效率，并采用響應曲面法優(yōu)化提取工藝，分析纖維素酶、果膠酶、酶解時間及酶解溫度對葛花原花青素提取率的影響，并建立數(shù)學模型。此外，利用Sephadex LH－20凝膠柱對葛花原花青素進行純化，分析其體外抗氧化活性，為葛花的綜合開發(fā)與利用提供理論及技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛花藥材 由廣州二天堂藥店提供，廣東省中藥研究所鑒定為粉葛(P.thomsonii Benth)的花，烘干磨粉后，過20目篩于冰箱冷藏備用;兒茶素標準品、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;乙醇、甲醇、香蘭素均為分析純。

KQ－SOOB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;THZ－82恒溫振蕩器 國華企業(yè);752－紫外分光光度計 上海分析儀器廠;N－1001真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;電子分析天平 梅斯特－拖利多儀器上海有限公司;CF16RXII高速冷凍離心機 日立。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛花原花青素的酶法提取 準確稱取預先處理好的葛花粉2.0g于錐形瓶中，加入20mL蒸餾水，加入纖維素酶、果膠酶在一定溫度下作用一定時間，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干大部分水分，余下的濾液加入60%的乙醇溶液至20mL，在60℃條件下提取2h，過濾、濃縮，定容，得提取液。將提取液稀釋一定倍數(shù)，測定原花青素的含量。

1.2.2 葛花原花青素提取工藝優(yōu)化 單因素實驗:果膠酶添加量0.4%，酶解時間2h，酶解溫度50℃的條件下，考察纖維素酶添加量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%)對原花青素得率的影響。纖維素酶添加量0.4%，酶解時間2h，酶解溫度50℃的條件下，考察果膠酶添加量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%)對原花青素得率的影響。纖維素酶添加量0.4%，果膠酶添加量0.6%，酶解溫度50℃的條件下，考察酶解時間(30、60、90、120、150min)對原花青素得率的影響。纖維素酶添加量0.4%，果膠酶添加量0.6%，酶解時間90min的條件下，考察酶解溫度(35、45、55、65、75℃)對原花青素得率的影響。分別研究纖維素酶添加量(X1)、果膠酶添加量(X2)、酶解時間(X3)和酶解溫度(X4)對提取效果的影響。在單因素實驗的基礎上，利用Box－Behnken中心組合實驗進行實驗設計，用Design Expert 8.0軟件進行響應面優(yōu)化分析，確定最佳提取工藝。因素水平編碼表如表1所示。

表1 響應曲面實驗設計因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

1.2.3 原花青素含量的測定 采用香草醛－鹽酸法［12］測定提取液中原花青素含量。以兒茶素標準品繪制標準曲線，測定提取液中原花青素的含量，按下式計算得率:

以兒茶素為標準品，分別配制濃度為50，100，150，200，250，300μg/mL的標準液，繪制標準曲線。得到回歸方程Y=0.003X+0.0433，R2=0.9945。

1.2.4 葛花原花青素的純化 在最優(yōu)工藝條件下提取葛花原花青素，對提取液進行濃縮，3000g離心15min，收集上清液，去除沉淀。將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，經(jīng) 0.45μm濾膜過濾，上樣至Sephadex LH－20凝膠柱。用50%甲醇洗脫至洗脫液無色，再用500mL 70%的丙酮溶液洗脫，收集丙酮洗脫部分，將洗脫液真空濃縮、冷凍干燥，得到原花青素，于－20℃冰箱中儲藏備用，同時測定原花青素的含量。

1.2.5 葛花原花青素的體外抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 參考Villa?o［13］等人的方法，略作修改。取不同濃度的原花青素溶液0.1mL，加入3.9mL質(zhì)量濃度為25mg/L的DPPH甲醇溶液中，搖勻，反應30min。在515nm處測吸光度。以VC作為對照。將IC50值定義為，DPPH自由基清除率達到50%時原花青素樣品的濃度。

按下式計算DPPH自由基清除率:

其中，A0為空白組吸光值，A1為樣品組吸光值。1.2.5.2 羥自由基清除能力 參考 Smimoff等人［14］的方法。取不同濃度的樣品0.5mL，依次加入1.5mL 2.0mmol/L的FeSO4溶液，1.5mL 6.0mmol/L的H2O2溶液，1.5mL 6.0mmol/L的水楊酸溶液。37℃反應30min后冷水冷卻。510nm處測吸光度。以VC作為對照。將IC50值定義為，羥自由基清除率達到50%時原花青素樣品的濃度。

羥自由基清除能力按下式計算:

其中，A0為空白組吸光值，A1為樣品組吸光值，A2為試劑空白的吸光值。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力 參考Li［15］的方法。50μL不同濃度的樣品溶液與2900μL的pH 7.4的Tris－HCl緩沖液(0.05moL/L，37℃)混合，加入50μL鄰苯三酚溶液(25μL 6.0mmol/L鄰苯三酚溶液與25μL 1mmol/L HCl溶液混合)，迅速混勻，37℃下反應，在325nm下測定反應5min時吸光度的變化，計算超氧陰離子自由基清除能力。以VC作為對照。將IC50值定義為，超氧陰離子自由基清除率達到50%時原花青素樣品的濃度。

按下式計算超氧陰離子自由基清除能力:

超氧陰離子自由基清除率(%)

其中，ΔAcontrol為空白組吸光度的變化，ΔAsample為樣品組吸光度的變化，T為測定時間，即5min。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 纖維素酶對原花青素得率的影響 圖1說明，在纖維素酶添加量小于0.4%時，原花青素得率隨纖維素酶添加量的增加而增加;在纖維素酶添加量達到0.4%時達最大，之后隨著纖維素酶添加量的增加反而呈下降趨勢。這可能由于當酶濃度提高到一定值后，底物濃度對酶不能達到飽和，導致酶的作用受到抑制［16］。因此，纖維素酶添加量選擇在0.2%～0.6 %為宜。

圖1 纖維素酶添加量對原花青素得率的影響Fig.1 Effect of cellulase on extraction of PC

2.1.2 果膠酶對原花青素得率的影響 由圖2可知，隨著果膠酶添加量的增加，原花青素得率逐漸增大，在0.6%左右達到最高。當果膠酶添加量超過0.6%后，原花青素得率逐漸下降。因此果膠酶添加量選擇在0.4%～0.8%為宜。

圖2 果膠酶添加量對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of pectase on extraction of PC

2.1.3 酶解時間對原花青素得率的影響 酶解時間太短影響酶解效果，太長則不利于工業(yè)生產(chǎn)。由圖3可知，30～90min內(nèi)原花青素得率隨著時間的增加而逐漸增大，這是因為隨著酶解時間的延長，酶解反應進行較為完全，原花青素更能有效溶出，使得原花青素得率增大。進一步延長酶解時間，得率反而降低，且會增加能耗，不利于生產(chǎn)。因此酶解時間選擇在60～120min為宜。

圖3 酶解時間對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of enzyme time on extraction of PC

2.1.4 酶解溫度對原花青素得率的影響 由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，原花青素的得率不斷增加，到65℃左右達到最高;繼續(xù)升高溫度，得率反而下降。說明溫度的升高對酶的作用有促進作用，這可能是由于較高的溫度使得酶活性增強，反應速度加快;但溫度過高會使酶活性減弱，酶的穩(wěn)定性降低，同時高溫會破壞原花青素的結(jié)構，導致得率下降，因此提取溫度不宜過高。綜上，酶解溫度選擇55～75℃為宜。

圖4 酶解溫度對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of enzyme temperature on extraction of PC

2.2 響應曲面實驗結(jié)果

響應曲面實驗設計及結(jié)果見表2。

表2 響應曲面實驗方案及結(jié)果Table 2 The design matrix andthe corresponding results of RSM experiments

利用Design－Expert軟件對表2實驗結(jié)果進行回歸分析，得到回歸方程:

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

對模型進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型的顯著水平遠遠小于0.05，說明模型效應顯著;失擬項p=0.5833＞0.05，說明方程對實驗的擬合度較好。顯著性分析可知，X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X12、、X32、對原花青素得率的影響顯著，說明纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時間及酶解溫度對原花青素得率的影響均達顯著水平。交互項中，纖維素酶添加量與果膠酶添加量、纖維素酶添加量與酶解時間、果膠酶添加量與酶解時間、果膠酶添加量與酶解溫度之間的交互作用顯著，而其他因素之間的交互作用不顯著。由F值可知，各因素對葛花原花青素得率影響的顯著性由大到小依次為X2(果膠酶添加量)＞X3(酶解時間)＞X1(纖維素酶添加量)＞X4(酶解溫度)。

利用Design－Expert軟件中的響應面和等高線圖對4因素間的交互作用進行分析，結(jié)果如圖5～圖10所示。

在酶解時間90min，酶解溫度65℃時，纖維素酶添加量和果膠酶添加量的響應面和等高線如圖5所示。由圖可知，纖維素酶添加量不變時，果膠酶對原花青素得率的影響呈先增大后減小的趨勢。而當果膠酶不變時，隨著纖維素酶添加量增大，原花青素的得率逐漸增大，之后略微降低。由方差分析結(jié)果可知，兩者交互作用顯著。

圖5 纖維素酶添加量和果膠酶添加量的響應面Fig.5 Response surfaces of cellulase and pectase

果膠酶添加量0.6%，酶解溫度60℃的條件下，纖維素酶添加量和酶解時間的響應面和等高線如圖6所示。由圖可知，當纖維素酶添加量不變時，酶解時間對原花青素得率的影響呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。而當酶解時間不變，隨著纖維素酶的增加，原花青素得率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在中心點附近達到最高值。由方差分析可知兩者交互作用顯著。

在果膠酶添加量0.6%，酶解時間90min的條件下，纖維素酶添加量和酶解溫度的響應面和等高線如圖7所示。由圖可知，當纖維素酶添加量不變時，酶解溫度對原花青素得率的影響先增加而后降低。當酶解溫度不變時，纖維素酶添加量對原花青素得率的影響與提取溫度類似，且在中心點附近達到最高值。

在纖維素酶添加量0.4%，酶解溫度65℃條件下，果膠酶添加量和酶解時間的響應面和等高線如圖8所示。從圖中可以看出，果膠酶添加量不變，隨著液料比的增大，原花青素得率逐漸增大。在酶解時間不變時，隨著果膠酶添加量增加，原花青素得率逐漸增加，后略微降低。由方差分析結(jié)果可知，兩者的交互作用顯著。

圖6 纖維素酶添加量和酶解時間的響應面Fig.6 Response surfaces of cellulase and enzyme time

圖7 纖維素添加量和酶解溫度的響應面Fig.7 Response surfaces of cellulase and enyzme temperature

圖8 果膠酶添加量和酶解時間的響應面Fig.8 Response surfaces of pectase and enzyme time

在纖維素酶添加量0.4%，酶解時間90min的條件下，果膠酶添加量和酶解溫度的響應面和等高線如圖9所示。由圖可知，果膠酶添加量一定時，隨著酶解溫度的增大，原花青素的得率逐漸增加，而后略微降低，在中心點附近原花青素得率達到最高。酶解溫度不變時，隨著果膠酶的增加，原花青素得率逐漸增大。由方差分析可知兩者的交互作用顯著。

纖維素酶添加量0.4%，果膠酶添加量0.6%的條件下，酶解時間和酶解溫度的響應面和等高線如圖10所示。由圖可知，當酶解時間一定時，隨著酶解溫度的增加，原花青素得率先增加后降低，在中心點附近達到最大值。當酶解溫度處于一定水平時，隨著酶解時間的延長，原花青素得率也呈先增大后下降的趨勢。

圖9 果膠酶添加量和酶解溫度的響應面Fig.9 Response surfaces of pectase and enzyme temperature

圖10 酶解時間和酶解溫度的響應面Fig.10 Response surfaces of enzyme time and enzyme temperature

利用已建立的數(shù)學模型在實驗范圍內(nèi)優(yōu)化出最優(yōu)條件為:纖維素酶添加量0.4%，果膠酶添加量0.69%，酶解時間92min，酶解溫度65℃。在此條件下，葛花原花青素的得率為5.02mg/g。

2.3 葛花原花青素的純化

為驗證模型的可靠性，在此條件下進行驗證實驗，葛花原花青素的平均得率為5.05mg/g。與理論預測值相比，其相對誤差約為0.60%，說明數(shù)學模型可靠。

2.4 葛花原花青素的體外抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一種相對穩(wěn)定的自由基，是評價抗氧化劑抗氧化能力的常用方法［17］。葛花原花青素對DPPH自由基的清除能力見圖11。

圖11 葛花原花青素的DPPH自由基清除能力Fig.11 DPPH radical scavenging activity of PC from puaearia

由圖11可知，原花青素對DPPH自由基的清除能力呈一定的量效關系，清除率隨著原花青素的濃度增加而逐漸增大。當原花青素濃度達到0.2mg/mL時，清除率在90%以上。以VC為對照，兩者的IC50值分別為0.087、0.105mg/mL，說明葛花原花青素呈現(xiàn)出較好的抗氧化活性。

2.4.2 羥自由基清除能力 羥自由基是活性較高的自由基，它與衰老、癌癥及多種疾病的發(fā)生有關［18］。清除羥自由基可能是防御一些疾病的有效手段。葛花原花青素對羥自由基的清除能力如圖12所示。

圖12 葛花原花青素的羥自由基清除能力Fig.12 Hydroxyl free radical scavenging activity of PC from puaearia and VCas positive control

由圖12可知，原花青素對羥自由基的清除能力呈一定的量效關系，清除率隨原花青素濃度的增加逐漸增大，在1.5mg/mL的濃度時即達到80%以上。以VC為對照，兩者的IC50值分別為0.767、1.310 mg/mL。

2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力 超氧陰離子自由基是活性氧之一。大量的超氧陰離子自由基會使細胞中超氧化物歧化酶鈍化［19］，從而使細胞受到毒害甚至死亡。超氧陰離子自由基清除率是常用的抗氧化活性指標。

由圖13可知，葛花原花青素是具有較高的超氧陰離子自由基清除能力，在0.6mg/mL的濃度時清除能力即達到90%以上。與VC相比，原花青素呈現(xiàn)較高的超氧陰離子自由基清除能力。兩者的IC50值分別為0.303mg/mL、0.371mg/mL。

圖13 葛花原花青素的超氧陰離子自由基清除能力Fig.13 Superoxide anion free radical scavenging activity of PC from puaearia and VCas positive control

3 結(jié)論

通過單因素實驗和Box－Behnken實驗設計優(yōu)化，研究纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時間和酶解溫度對葛花原花青素得率的影響。經(jīng)優(yōu)化實驗得到的最佳提取工藝為:纖維素酶添加量0.40%，果膠酶添加量0.69%，酶解時間92min，酶解溫度65℃。在此條件下，葛花原花青素的得率為5.02mg/g。所得原花青素具有良好的抗氧化活性，其DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率的IC50值分別為0.087，0.767，0.303mg/mL。

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