俞雯雯(綜述)，史麗云(審校)

(1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，杭州 310053； 2.杭州師范大學醫(yī)學院,杭州 310036)

炎癥性疾病與代謝性疾病、自身免疫性疾病、神經退行性疾病甚至腫瘤等重要疾病密切相關。中藥資源豐富，來源廣泛，利用中藥進行抗炎治療在國內外已得到廣泛應用。例如,板藍根可以用于治療急性扁桃體炎、咽喉炎[1]；魚腥草、金銀花可以用于治療肺炎[2-3]；馬齒莧水煎液可用于治療急性腸炎[4]；黃連主治急性結膜炎[5]；蒲公英可用于治療急性扁桃體炎等[6]。此外，中草藥也可用于治療慢性疾病，如慢性肝炎、風濕性關節(jié)炎和炎癥性腸病等[7-9]。一些中藥活性成分如苷類、生物堿類、黃酮類、萜類、揮發(fā)油等都具有很好的抗炎作用，對這些成分的抗炎機制的研究給人們認識中藥提供了新的思路。蛋白質泛素化修飾是一種可逆的共價修飾過程，能夠調節(jié)被修飾蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)等，是人體眾多生理和病理反應的重要調節(jié)機制。泛素化修飾也是炎癥信號途徑中一種重要的調控方式。有研究顯示，以泛素化修飾為主要作用靶位的炎癥信號調節(jié)機制已成為中藥抑炎的一種新的作用模式[10]。

1 泛素與泛素化調控

泛素是一種相對分子質量為8.6×103的小分子蛋白，包含76個氨基酸，在真核生物中具有高度保守性。泛素本身含有7個賴氨酸殘基，因此它們之間也可以通過這些位點互相連接，形成多泛素蛋白鏈。泛素和其他類泛素蛋白一樣，具有特異的轉錄后調控作用[11]。蛋白質的泛素化由三種酶催化進行，分別是泛素活化酶(ubiquitin-activating enzymes,E1)、泛素綴合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2)及泛素-蛋白質連接酶(ubiquitin ligases,E3)[12]。首先，E1將腺苷三磷酸水解成腺苷一磷酸，并將一個泛素分子腺苷酸化；隨后泛素被轉移到E1活性中心的半胱氨酸殘基上，并伴隨著第二個泛素分子的腺苷酸化；被腺苷酸化的泛素分子隨之被轉移到E2的半胱氨酸殘基上。在此基礎上，E3通過選擇性識別底物與E2催化泛素從E2轉移到靶蛋白上，并通過異肽鍵與之相連。泛素可以單體形式與靶蛋白連接，也可通過E1、E2、E3的重復循環(huán)，促進了泛素與其他泛素的連接以形成多聚泛素鏈[12-13]。以單體或以多聚泛素鏈形式取決于蛋白分子內部的賴氨酸殘基或N端甲硫氨酸的類型。多聚泛素鏈的連接位點能夠影響底物的命運，如果多泛素蛋白鏈與被修飾蛋白上的第48位賴氨酸殘基相連，可介導靶蛋白進入蛋白酶體而被降解；如果與被修飾蛋白上其他位點，如第63位賴氨酸殘基相連，則靶蛋白不被降解而發(fā)揮信號途徑功能，如調控DNA損傷修復、染色質重構、囊泡運輸及蛋白激酶激活等[14]。泛素化修飾途徑是一可逆過程，即可以通過去泛素化酶將泛素蛋白修飾物除去，這種可逆的修飾途徑非常適合作為維持眾多生命活動的調控機制。

如同眾多蛋白質轉錄后調控方式，如磷酸化、甲基化、乙?；?、羥基化、糖基化等，泛素化調控了許多重要的細胞功能，特別是一些關鍵的細胞內活動，包括蛋白酶體的降解、DNA的損傷修復、膜轉運及信號轉導等，炎癥信號的轉導同樣受到泛素化機制的調控[13,15]。

2 泛素化調控與炎癥通路

炎性反應是機體針對感染因子或有害物質等產生的應激反應。正常狀態(tài)下的炎癥應答可以通過動員一系列炎性細胞和效應分子等，有效清除有害因子，恢復機體生理平衡。而過度的炎性反應造成組織損傷、功能紊亂，進而引發(fā)各類炎癥性疾病，如自身免疫性疾病、退行性疾病、腫瘤等。因此，炎癥的發(fā)生、發(fā)展和平息等過程受到一系列因子的嚴密調控。作為生物體內非常重要的一種調控手段—泛素化修飾途徑，毫無疑問也在炎癥信號轉導過程中起到了重要作用。

炎癥信號的轉導起始于機體免疫細胞或其他組織細胞對病原相關分子或危險相關分子模式的識別或活化，并通過一系列接頭分子參與的級聯(lián)反應，最終引起轉錄因子的活化和炎性效應分子的表達。轉錄因子,如核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、活化蛋白1、干擾素調節(jié)因子等決定著炎性細胞因子、趨化因子和其他效應分子的轉錄表達。在已知的轉錄因子中，NF-κB是參與炎癥基因表達調控的一個關鍵分子[16-17]。

NF-κB信號途徑廣泛存在，但是在大部分細胞中它都處于失活狀態(tài)；在包括來自微生物等的各種刺激因子的作用之下，細胞通過Toll樣受體、NOD樣受體、RIG-I樣受體等介導的途徑而被活化。在這個過程中，泛素化修飾扮演著重要的角色。以Toll樣受體4介導的信號途徑為例，位于細胞膜或內體的Toll樣受體4分子通過感受病原相關分子而活化，并通過Toll-白細胞介素1受體結構域，與髓樣分化初始應答基因88蛋白發(fā)生相互作用。隨即，髓樣分化初始應答基因88蛋白招募和活化白細胞介素1受體相關激酶家族蛋白，促進腫瘤壞死相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)蛋白的寡聚化。TRAF6蛋白本身即是一種E3，它與E2一起催化第63位賴氨酸位點的泛素化，并形成多泛素蛋白聚合體。這種多泛素蛋白進一步激活轉化生長因子β相關激酶1蛋白，由此引起IκB蛋白的磷酸化和活化。轉化生長因子β相關激酶1蛋白也能通過磷酸有絲分裂原激活蛋白激酶而激活c-Jun N端激酶和p38激酶信號途徑。IκB激酶的活化是引起后續(xù)IκB蛋白磷酸化和NF-κB活化的關鍵步驟，在這一階段中泛素化又起著決定性的作用[18-20]。

NF-κB信號在大部分細胞中處于失活狀態(tài)，主要是因為NF-κB亞基分子被IκB結合而被“禁錮”于細胞質中。上述Toll樣受體介導的IκB的活化可導致IκB蛋白快速發(fā)生磷酸化修飾，從而招募含有F-box結構域的蛋白β-TrCP、SKP1等蛋白，與E3形成復合體。該復合體與E2共同作用，導致已被磷酸化的IκB蛋白發(fā)生多泛素化修飾。這種被泛素化修飾后的IκB蛋白雖仍與NF-κB蛋白結合在一起，但是很快就會被26S蛋白酶體降解，從而“釋放”出NF-κB蛋白，進而引起NF-κB入核和炎癥相關基因的轉錄表達[21-22]。

由此可見，泛素化修飾決定了NF-κB的活化過程；與之相反，為了保證在更為精細水平上對NF-κB途徑實行調控，去泛素化酶可通過去除泛素蛋白修飾物來發(fā)揮炎癥抑制作用[23]。目前已知的去泛素化酶蛋白有90多種，其中包括Cylindromatosis、腫瘤壞死因子α誘導的蛋白3等重要的炎癥調控分子。Cylindromatosis蛋白含有3個細胞骨架相關蛋白、甘氨酸結構域和1個泛素蛋白特異性蛋白酶催化結構域。因此，Cylindromatosis蛋白能高度特異性地水解63位賴氨酸連接的多泛素蛋白復合體，從而阻止轉化生長因子β相關激酶1蛋白、c-Jun N端激酶蛋白和IκB蛋白的活化。與此相一致，Cylindromatosis突變小鼠表現(xiàn)出了與IκB過度激活有關的炎性反應特征[24-25]。A20蛋白是另一類通過泛素修飾途徑來抑制NF-κB信號途徑的調控分子。研究顯示，A20可通過其去泛素化作用中止K63多聚泛素鏈或通過阻斷TRAF6與E2的相互作用，來抑制TRAF6的信號轉導[26]；此外，A20還可催化TRAF6的K48泛素化，使其降解，導致信號鏈的完全終止[27]。因此，A20基因剔除小鼠表現(xiàn)為針對脂多糖的敏感性異常增高，機體發(fā)生嚴重的多器官炎癥[28-31]。

3 泛素化調控與中藥抗炎

近年來，隨著人們對炎癥本質和其分子機制研究的深入，有關中醫(yī)抗炎機制的研究也逐漸從單純的現(xiàn)象觀察和描述深入到分子和細胞水平。針對臨床療效突出的一些中藥抗炎機制的研究表明，某些藥物分子不但在轉錄水平上參與炎癥信號分子的表達調控，而且也參與蛋白水平上的表達調控。對關鍵信號分子的泛素化修飾調控已成為中藥抗炎的一種新機制。

紫花前胡苷是從朝鮮當歸根部分離出來的一種香豆素類化合物，具有神經保護、抗菌和記憶增強等功效。Rim等[32]發(fā)現(xiàn),紫花前胡苷在體內外具有抗炎作用，可顯著抑制脂多糖誘導的炎性因子，如腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β和誘導性一氧化氮合酶、環(huán)加氧酶的表達，并對小鼠致死性內毒素休克起到一定的保護作用。進一步研究顯示紫花前胡苷能抑制IκBα/β激酶的磷酸化，降低IκBα的降解速率。而與此相關聯(lián)的上游事件是由于紫花前胡苷可引起TRAF6泛素化水平的顯著降低，并顯著抑制脂多糖誘導的轉化生長因子激酶TANK結合激酶1與TRAF6的結合，進而抑制下游炎性途徑的活化。同樣，中藥單體澤蘭內酯亦是通過抑制TRAF6的泛素化以及蛋白酶體依賴的降解途徑，來調控轉錄因子NF-κB及活化蛋白1介導的炎性基因的表達。澤蘭內酯是從旋復花中提取而得到的倍半萜內酯，常被用于治療支氣管炎等炎性疾病，對其分子機制的研究為該藥物的臨床應用提供了充分的理論依據(jù)[33]。

雷公藤甲素是從中草藥雷公藤的根﹑葉﹑花及果實中提取的一種環(huán)氧二萜內酯化合物，具有抗炎及免疫抑制活性。盡管對其作用機制尚未完全搞清，但研究顯示與其對NF-κB信號途徑的調控作用密切相關。Park等[34]發(fā)現(xiàn),納摩爾級的雷公藤甲素可以抑制組成性和誘導性的NF-κB激活，但是這種抑制作用不是通過直接抑制p65與DNA的結合來實現(xiàn)的。研究表明，雷公藤甲素阻斷了腫瘤壞死因子誘導IκBα的泛素化和磷酸化過程，抑制了其活化后的降解過程，最終使p65與乙酰化酶CBP/p300的結合能力下降，阻礙了腫瘤壞死因子引起的炎性因子的轉錄表達和炎癥應答的發(fā)生。

另一種以NF-κB介導的信號途徑為主要調控靶點的藥物是硫秋水仙苷，一種提取自植物嘉蘭的秋水仙堿苷，并經半合成而得。該藥物是一種肌肉松弛劑，具有止痛抗炎作用，常被用于治療風濕病和骨科疾病。研究證實,硫秋水仙苷可有效抑制IκBα的泛素化，以及由此引發(fā)的蛋白酶體介導的降解作用，從而抑制NF-κB信號途徑[35]。由于NF-κB在炎癥和腫瘤發(fā)生過程中的重要作用，硫秋水仙苷不但顯示出其顯著的抗炎活性，而且可通過抑制NF-κB介導的抗凋亡基因表達而發(fā)揮抗腫瘤作用。

值得注意的是，有些中藥，如鐵線蕨乙醇提取物可以阻斷腫瘤壞死因子α誘導的NF-κB激活，但是它對NF-κB激活中所需的泛素化過程卻沒有任何影響，表明不同的中藥分子在調控NF-κB介導的炎癥途徑中具有特異性的作用靶位[36]。

炎性反應是一種多因子參與、多步驟、多階段的復雜過程，并受到多種調控途徑的影響。在不同生理和病理機制下，炎性因子的表達特征、表達水平不但取決于轉錄因子的調控，而且也受到轉錄后調控機制的影響。姜黃素是一種具有抗炎活性的天然多酚粗提液化合物，先前研究表明姜黃素能夠抑制脂多糖誘導的誘導性一氧化氮合酶基因的轉錄表達。而最近的研究顯示，姜黃素還能促進脂多糖誘導的誘導性一氧化氮合酶的泛素化修飾，引發(fā)蛋白酶體依賴的降解過程，進而快速清除體內炎性因子。這種在轉錄后水平直接調控炎性因子穩(wěn)定性的方式為炎癥調控研究提供了新的思路[37]。

在一些炎癥相關疾病的治療過程中，以泛素化修飾為靶標的中藥療法也顯示了其潛力。心肌癥是杜氏肌營養(yǎng)不良癥的主要致死原因，其典型病變是心肌肥大及纖維化，而其中具為關鍵致病作用的蛋白分子是促肥厚蛋白p300。實驗觀察發(fā)現(xiàn)，口服白藜蘆醇可以顯著抑制病變癥狀，恢復肌營養(yǎng)不良大鼠的心臟舒張功能。機制研究顯示，白藜蘆醇可以激活尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的脫乙酰酶蛋白1，并通過脫乙酰酶蛋白1的作用引起關鍵蛋白p300脫乙酰和泛素化修飾。這種泛素化修飾可引起蛋白酶體介導的降解過程，由此有效地抑制了致病因子p300的累積[38]。

4 展 望

中藥抗炎作用機制的研究已突破以往中藥藥理研究的低水平重復現(xiàn)象，研究人員不僅從炎癥的不同環(huán)節(jié)及途徑對其抗炎作用機制進行研究，而且開始從分子、基因水平探討中藥的作用機制。但是，目前有關中藥的抗炎機制仍然了解不多，尤其對其分子信號途徑的認識還不夠透徹。由于中藥是天然藥物，一味藥包含多種成分，它們具有相同或相異的抗炎作用機制，而且這些不同的抗炎作用是否起協(xié)同作用，是如何起協(xié)同作用等并不十分清楚，中藥的多組分決定了其抗炎作用的復雜性。結合基因組學、轉錄組學、表觀遺傳學、代謝學、免疫學等研究領域的前沿理論和技術，從現(xiàn)代分子-細胞-整體的角度來解析中藥抗炎的新機制，將會給古老的中醫(yī)臨床治療帶來新的生機。

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