王冠穎，姜仁禮，李欣然，高 利

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

咪達(dá)唑侖，又稱為咪唑安定，是一種短效的苯二氮卓類藥物,有起效迅速、高效、低毒的特點(diǎn)，根據(jù)使用劑量不同發(fā)揮鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、抗驚厥、抗癲癇及肌松作用。有研究表明，咪達(dá)唑侖與氯胺酮復(fù)合使用具有相加作用，可以有效降低肌肉緊張程度，增強(qiáng)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用[1]。咪達(dá)唑侖與隆朋和氯胺酮復(fù)合用于貓能產(chǎn)生確實(shí)的麻醉效果，但對貓的心臟功能抑制明顯[2]。它作為復(fù)合麻醉劑的主要成分已被廣泛研究并用于臨床實(shí)踐。但是，咪達(dá)唑侖對中樞的作用機(jī)制還不是很清楚。本試驗(yàn)通過使用咪達(dá)唑侖對山羊進(jìn)行麻醉，監(jiān)測不同腦區(qū)谷氨酸（glutamic acid，Glu）、天門冬氨酸（aspartic acid，Asp）含量的變化，以探討咪達(dá)唑侖可能對中樞麻醉作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 Waters600高效液相色譜系統(tǒng)；色譜柱Symmetry C18（4.6×150mm，5μm）；L-谷氨酸（LGlu）標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司，批號：BCBB5881；天門冬氨酸（Asp）標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司，批號：129K0181；2，4-二硝基氟苯：Sigma公司，批號D1529；色譜級甲醇；色譜級乙腈。

1.2 試驗(yàn)動物分組 八月齡健康山羊25只，雌雄兼用，體重13～15 kg，購自哈爾濱市香坊區(qū)某養(yǎng)殖場，按試驗(yàn)動物要求飼養(yǎng)管理，臨床檢查健康。隨機(jī)分為對照組、誘導(dǎo)組、麻醉組、恢復(fù)I組和恢復(fù)II組共5個(gè)試驗(yàn)組，每組5只。

1.3 樣品采集和處理 對照組肌肉注射生理鹽水（1.31mL/kg）處死后立即取腦組織，試驗(yàn)組肌肉注射咪達(dá)唑侖（14mg/kg）后，根據(jù)山羊行為學(xué)變化分別于山羊倒地不起(誘導(dǎo)組)、翻正反射消失(麻醉組)、翻正反射恢復(fù)（恢復(fù)I組）和翻正反射恢復(fù)后6 h（恢復(fù)II組）處死立即取腦組織。在上述時(shí)間點(diǎn)對山羊進(jìn)行處死并立即取腦組織，在冰面上分離大腦、海馬、丘腦、小腦和腦干，取腦組織加入9倍體積的甲醇/水溶液（50∶50），手動勻漿數(shù)次后將勻漿液注入EP管中；離心30 min（4℃）3 000 r/min，取上清液-80℃保存。檢測時(shí)取腦組織勻漿上清400μL，加入200μL乙腈，混勻，高速離心10min（4℃）15 000 r/min，取上清液加入0.5 mol/L NaHCO3溶液400μL，再加入0.5%的2，4-二硝基氟苯200μL，渦旋混勻，于65℃恒溫水浴鍋中衍生55 min，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，取20μL進(jìn)樣。

1.4 檢測條件 色譜柱美國Waters公司生產(chǎn)Symmetry C18（4.6×150 mm，5μm）；流動相：A為0.05mol/L的醋酸鈉緩沖液（pH=6.6），B為乙腈/水（V/V=50∶50），進(jìn)行梯度洗脫，流動相B的濃度由初始時(shí)65%經(jīng)10 min至10%，18 min至40%；流速：0.6 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：28℃。取20μL進(jìn)樣分析，采用外標(biāo)法定量。

1.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 19數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)做單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P≥0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 咪達(dá)唑侖麻醉后山羊不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)Glu的含量 如表1所示：大腦Glu含量在恢復(fù)I組下降14%，與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。海馬和小腦Glu含量在麻醉期下降至最低，分別下降6%和7%，與對照組比較差異顯著（P＜0.05）。腦干Glu含量在誘導(dǎo)組和麻醉組下降14%和20%，與對照組比較差異極顯著（P＜0.01），在恢復(fù)I組雖略有回升，但與麻醉組比較無顯著差異（P＞0.05），與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。丘腦Glu含量在麻醉期下降5%，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各腦區(qū)Glu含量在恢復(fù)II期均恢復(fù)到正常水平。

2.2 咪達(dá)唑侖麻醉后山羊不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)Asp的含量 如表2所示：咪達(dá)唑侖麻醉對山羊不同腦區(qū)Asp含量的影響呈現(xiàn)兩種不同的趨勢。大腦、小腦和腦干Asp含量在麻醉期達(dá)最大值，分別升高34%（P＜0.05）、29%（P＜0.05）和40%（P＜0.01）；并在恢復(fù)I組下降，小腦和腦干與麻醉組相比差異顯著（P＜0.01或P＜0.05）；在恢復(fù)II組顯著恢復(fù)至正常水平（P＜0.05），與麻醉期比較差異顯著（P＜0.01或P＜0.05）。而海馬與丘腦Asp含量則在麻醉期顯著下降，分別下降22%（P＜0.01）和16%（P＜0.05）；恢復(fù)I組丘腦Asp含量依然低于正常水平（P＜0.05）；至恢復(fù)II期兩腦區(qū)Asp含量均顯著恢復(fù)（P＜0.05），且與麻醉期比較差異顯著（P＜0.05）。

表1 咪達(dá)唑侖麻醉后山羊不同腦區(qū)G lu的含量

3 討論

谷氨酸（Glu）是動物體內(nèi)的一種非必需氨基酸，在化學(xué)突觸中被儲存在囊泡中。神經(jīng)沖動觸發(fā)突觸前膜釋放谷氨酸，到達(dá)突觸后膜后，激活谷氨酸受體，產(chǎn)生興奮性突觸后電位。Glu的作用不僅是在突觸內(nèi)點(diǎn)對點(diǎn)傳遞興奮，它也可以溢出突觸，在突觸之間與鄰近的突觸進(jìn)行突觸外信號傳輸[3]。此外，谷氨酸也可作為GABA能神經(jīng)元合成抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的前體，反應(yīng)由谷氨酸脫羧酶（GAD）催化。NMDA受體是最重要的谷氨酸受體，許多研究表明，氯胺酮的麻醉和致幻效果與其非競爭拮抗谷氨酸NMDA受體有關(guān)[4]。目前全麻藥與Glu及NMDA受體的關(guān)系大多局限于靜脈麻醉藥和吸入麻醉藥的中樞機(jī)制[5-6]，有關(guān)咪達(dá)唑侖的研究較少。趙秋華等[7]研究證明，咪達(dá)唑侖可增強(qiáng)氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用，腹腔注射咪達(dá)唑侖后，對大腦皮層的抑制作用加強(qiáng)，麻醉深度進(jìn)一步加深，并引起大鼠腦大腦皮層谷氨酸含量的顯著下降，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，在本試驗(yàn)大腦中Glu在恢復(fù)I期含量仍持續(xù)降低，可能與這種抑制作用有關(guān)。咪達(dá)唑侖麻醉使山羊大腦、海馬、小腦和腦干Glu含量下降，提示咪達(dá)唑侖的麻醉作用可能與減少Glu的合成與釋放，減少興奮性突觸的傳遞有關(guān)。

天門冬氨酸（Asp）為酸性氨基酸，是普遍存在于生物體內(nèi)的非必需氨基酸。Asp是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，由突觸前膜釋放，作用于突觸后膜Glu受體，但不如谷氨酸作用強(qiáng)烈[8]。Asp、Glu及NMDA受體與學(xué)習(xí)、記憶及多種急慢性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、治療效果等有著密切關(guān)系[9]。全麻藥對神經(jīng)遞質(zhì)Asp的影響報(bào)道較少。本試驗(yàn)中大腦、小腦和腦干Asp含量先升高后降低，而海馬與丘腦Asp含量則先下降后上升至正常水平，說明咪達(dá)唑侖對不同腦區(qū)的Asp作用不同，對大腦、小腦和腦干的作用是先產(chǎn)生興奮作用接著轉(zhuǎn)為抑制，這表明，對于Asp來說，山羊的大腦、小腦和腦干不是咪達(dá)唑侖麻醉時(shí)作用的靶位腦區(qū)，而海馬與丘腦可能為咪達(dá)唑侖麻醉時(shí)作用的主要腦區(qū)。

4 結(jié)論

咪達(dá)唑侖使海馬和丘腦Glu和Asp含量降低，因此海馬和丘腦可能是咪達(dá)唑侖與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用的靶位之一，在咪達(dá)唑侖全麻作用中發(fā)揮重要作用。

[1]陳鴻，潘寧玲.全身麻醉誘導(dǎo)時(shí)咪唑安定與氯胺酮催眠相互作用的研究[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2010，26（10）：851-853.

[2]劉偉，崔文，彭麗艷，等.隆朋-氯胺酮-咪達(dá)唑侖復(fù)合制劑對貓麻醉效果及心肺功能的影響[J].中國獸醫(yī)雜志，2008，44（10）：46-47.

[3] Kubo Y，Sekiya H，Namiki S，et al.Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107（14）：6526.

[4]張志龍，費(fèi)劍春，段世明，等.NMDA受體與氮胺酮麻醉[J].國外醫(yī)學(xué).麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊，2000，21（1）：13-15.

[5]Zhang H，Wang W，Gao W.Effect of propofol on the levels of neurotransmitters in normal human brain：A magnetic resonance spectroscopy study[J].Neuroscience Letters，2009，467（3）：247-251.

[6]Siegal N，Dow-Edwards D.Isoflurane anesthesia interferes with the expression of cocaine-induced sensitization in female rats[J].Neuroscience Letters，2009，464（1）：52-56.

[7]趙秋華，岳云，于代華，等.氯胺酮和咪唑安定麻醉下腦皮層谷氨酸含量的變化：活體腦微透析研究[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2001，17（7）：381-384.

[8]Chen P E，Geballe M T，Stansfeld P J.et al.Structural Features of the Glutamate Binding Site in Recombinant NR1/NR2A NMethyl-D-aspartate Receptors Determined by Site-Directed Mutagenesis and Molecular Modeling[J].Mol.Pharmacol，2005，67（5）：1470-1484.

[9]蔡桂蘭，賈建平.輕度認(rèn)知障礙和阿爾茨海默病患者血清中興奮性氨基酸的含量[J].中華神經(jīng)科雜志，2007，40：544-548.