周文君，孫裕光，沙 莎

（西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶 榮昌402460）

乳房炎是由于病原微生物侵入奶牛乳腺組織所引起的一種嚴重危害奶牛業(yè)發(fā)展的常見病、多發(fā)病。主要引起乳房炎的致病菌已報道約80多種，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、微球菌等。環(huán)境的微生物也是引起牛乳房炎的另一致病因素，如肺炎克雷伯菌、假單胞菌等革蘭陰性病原菌等[1]?？股貫榕R床治療牛乳房炎的首選藥物，但因抗生素導致的耐藥性給乳房炎的治療帶來很大的困難，在對乳房炎藥物治療過程中的藥物殘留也成為牛奶品質(zhì)和牛乳食品安全的一大隱患。本試驗對該牛場患乳房炎奶牛的乳汁進行病原菌分離鑒定以及藥敏試驗，以期獲得患病牛乳的細菌種類和敏感藥物或耐藥菌株存在狀況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 樣品為重慶市某奶牛場患臨床型或亞臨床型乳房炎牛奶，如乳房紅、腫，部分乳房出現(xiàn)萎縮或硬塊；表現(xiàn)產(chǎn)奶量下降癥狀的病牛。每頭病牛采集的牛乳樣品為1份：采樣前消毒乳房及4個乳區(qū)，各乳區(qū)采乳約10mL，盛于滅菌燒瓶中。共采10頭牛，10份樣品混合，暫保存于4℃的冰箱，72 h內(nèi)進行細菌分離，獲得菌株。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯等按常規(guī)方法制作。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、生化鑒定所用的微量發(fā)酵管，購自杭州天和微生物試劑有限公司，批號：20120301，20120111。紅霉素、恩諾沙星、氨芐青霉素、鏈霉素、頭孢噻吩、乙酰螺旋霉素、阿莫西林、氟哌酸、磺胺異惡唑等試驗用藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號：110817。

1.3 試驗動物 昆明系小鼠60只，購自瀘州醫(yī)學院實驗動物中心，養(yǎng)1周后用于致病性試驗。

1.4 方法

1.4.1 細菌分離培養(yǎng)及計數(shù) 無菌操作，取10-1稀釋乳樣0.2mL，用“L”棒涂布于鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。進行菌落計數(shù)，挑取培養(yǎng)基上的不同生長特征的菌落進行純化，將純培養(yǎng)物編號保存，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 分離菌形態(tài)學及培養(yǎng)特性觀察 將已純化菌株進行革蘭染色鏡檢，并觀察菌落生長特性及在不同基質(zhì)上生長狀況。

1.4.3 分離菌生化鑒定 按細菌編碼鑒程序?qū)Ψ蛛x純化的細菌分別進行生化鑒定：G-、氧化酶試驗陰性菌直接用腸桿菌科細菌編碼鑒定。G-、氧化酶試驗陽性、O／F試驗陽性菌通過厭氧葡萄糖試驗即可進行弧菌科生化編碼鑒定。G+球菌通過觸酶、葡萄糖發(fā)酵、玻片凝固酶、試管凝固酶、新生霉素試驗、動力和溶血試驗鑒定；試驗結(jié)果根據(jù)伯杰細菌鑒定手冊和常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊判定細菌種類。部分G+桿菌使用BIOFOSUNGP48板條用BIOFOSUN微生物鑒定系統(tǒng)（上海復星佰珞生物技術(shù)有限公司）鑒定。

1.4.4 分離菌致病性試驗 將60只小鼠隨機分成12組[2]，11組做試驗組，1組做對照組，每組5只，隔離飼養(yǎng)。將分離的11株菌的24h肉湯培養(yǎng)物對小鼠進行腹腔注射0.2mL/只（1.5×109/mL），對照組注射滅菌生理鹽水0.2 mL/只。觀察記錄小鼠的存活情況。死亡者剖檢觀察病變并進行細菌分離鑒定。

1.4.5 致病菌藥敏試驗 用引起小鼠死亡的菌株和常用抗生素藥紙片，按紙片擴散法（Kirby-Baueer Dise Diffusion）進行試驗。37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，測量抑菌圈的直徑，以CLSI的判定標準判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 樣本細菌分離培養(yǎng)和計數(shù) 患乳房炎的乳汁樣本中平均細菌總數(shù)1.42×103CFU/mL，少于國家衛(wèi)生標準GB 19301-2010鮮牛標準（2×106CFU/mL）。從中分離到11株細菌進行鑒定。

2.2 分離菌形態(tài)學及生化鑒定 樣本中11株細菌，經(jīng)形態(tài)學和生化鑒定有8種菌：YR-1、YR-3、YR-7為嗜水氣單胞菌，占分離菌27.3%；YR-2、YR-5為微球菌，占分離菌18.2%；YR-4為鮑曼不動桿菌，占分離菌9.1%；YR-6為表皮葡萄球菌，占分離菌9.1%；YR-8為枯草桿菌，占分離菌9.1%；YR-9為溫和氣單胞菌，占分離菌9.1%；YR-10為克里斯坦森耶爾森氏菌，占分離菌9.1%；YR-11為海魚弧菌，占分離菌9.1%。鮮血瓊脂培養(yǎng)基上鮑曼不動桿菌(YR-4)呈β溶血，枯草桿菌（YR-8）呈α溶血。

2.3 分離菌致病性試驗 樣本中8種細菌，有5種菌具有致病性，分別是表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、嗜水氣單胞菌、枯草桿菌和微球菌，致病菌的檢出率為54.5%。其中表皮葡萄球菌和嗜水氣單胞菌致病力最強，試驗小鼠100%死亡，微球菌、鮑曼不動桿菌和枯草桿菌使試驗小鼠80%死亡，死亡小鼠均出現(xiàn)不同程度的敗血癥癥狀；對病死小白鼠的臟器分離培養(yǎng)鑒定，均回收到原菌。另外克里斯坦森耶爾森氏菌、海魚弧菌、溫和氣單胞菌接種的小鼠未出現(xiàn)死亡。對照組小鼠未見不良癥狀。

2.4 藥敏試驗 選用鏈霉素、諾氟沙星等9種常用藥物和5種致病性菌作藥敏試驗。結(jié)果（見表1）：嗜水氣單胞菌對氨芐青霉素、頭孢噻吩藥物耐藥，枯草桿菌對氨芐青霉素、頭孢噻吩、阿莫西林和磺胺藥物耐藥。其他的菌株對這9種藥物均敏感。

表1 藥敏試驗結(jié)果 （株）

3 分析與討論

該奶牛場是重慶市某奶牛產(chǎn)業(yè)鏈中奶牛養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中的一個，由各個奶牛養(yǎng)殖場組成的養(yǎng)殖集團生產(chǎn)鮮乳，鮮奶的質(zhì)量和產(chǎn)量至關(guān)重要，了解牛養(yǎng)殖場奶牛乳房炎基本狀況可以為科學養(yǎng)殖管理提供科學依據(jù)。

樣本細菌總數(shù)的結(jié)果少于國家衛(wèi)生標準其原因或是使用抗生素藥物治療乳房炎的緣故。在樣本中分離鑒定出8種11株菌，其中嗜水氣單胞菌、微球菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌和枯草桿菌5種菌對小白鼠有致病性。從細菌的種類上比較，該牛場致病菌種類與文獻報道[1-8]結(jié)果略有不同，其中鮑曼不動桿菌、嗜水氣單胞菌在乳房炎病例中少有報道。表皮葡萄球菌和嗜水氣單胞菌致病力最強，可使試驗小白鼠100%死亡，是引發(fā)該奶牛場乳房炎的主要病原。鮑曼不動桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見致病菌之一，為條件致病菌[6]?？莶輻U菌在通常情況下為非致病菌，但某些情況下枯草桿菌亦可導致人體感染[7]。此時在乳房炎牛乳中發(fā)現(xiàn)并使試驗小鼠80%死亡，說明鮑曼不動桿菌和枯草桿菌是主要的致病因素之一。嗜水氣單胞菌在樣本中分離出說明牛場環(huán)境有嗜水氣單胞菌污染，環(huán)境條件惡劣，牛體抵抗力低下時，可造成乳房炎的發(fā)生。樣本中有微球菌的結(jié)果與報道同[8]。此外在乳樣中還有克里斯坦森耶爾森氏菌、海魚弧菌、溫和氣單胞等條件致病菌[10]，雖檢出率均低為10%,并且未引起小鼠死亡，但這些菌的生存條件是濕熱環(huán)境；牛舍環(huán)境潮濕為致病菌和條件致病菌提供溫床。當動物機體的抵抗力下降，使動物感染疾病的機率增加，牛乳房炎亦是如此。

臨床上抗生素為治療牛乳房炎的首選藥物，試驗結(jié)果顯示嗜水氣單胞菌對氨芐青霉素、頭孢噻吩藥物耐藥，枯草桿菌對氨芐青霉素、頭孢噻吩、阿莫西林和磺胺藥物耐藥。其中氨芐青霉素、頭孢噻吩藥物為廣譜抗菌藥，常用于臨床用藥，嗜水氣單胞菌對產(chǎn)生耐藥的原因可能不僅僅是因為臨床的濫用，也可能是因為嗜水氣單胞菌能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶降解青霉素有關(guān)[8]。在臨床治療時應避免選擇已產(chǎn)生耐藥的氨芐青霉素、頭孢噻吩等藥物，而鏈霉素和氟哌酸等藥物對該牛場致病菌有較好的抑菌效果。另外紅霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[5]，對部分革蘭陰性菌有抑菌作用，鮑曼不動桿菌在結(jié)果中顯示對紅霉素敏感，這一結(jié)果少有報道，或可為鮑曼不動桿菌研究和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗菌研究提供素材。

綜上所述，試驗研究證明該牛舍環(huán)境潮濕，飼養(yǎng)狀況差是該牛場存在的問題之一，在對乳房炎進行治療時，除了使用抗菌敏感藥物外，還應全方位改善飼養(yǎng)環(huán)境，定期對牛群排查、治療，及時消除潛在的隱患，以減少奶牛乳房炎帶來的經(jīng)濟損失。

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