俞 燕，張 斌，龔建森，于恩琪，莊林林，張 笛，劉學(xué)賢，徐 步

（1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州225125；2.揚(yáng)州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇 揚(yáng)州225009；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

沙門(mén)菌廣泛存在于人和其他動(dòng)物腸道內(nèi)，是重要的人畜共患病病原之一。自然界中，家禽是沙門(mén)菌的重要宿主，沙門(mén)菌感染家禽后，可引起發(fā)病或死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。更為重要的是，污染沙門(mén)菌的禽肉、禽蛋等禽產(chǎn)品還會(huì)造成食品安全問(wèn)題，影響公共衛(wèi)生和社會(huì)安全[1]。因此，家禽養(yǎng)殖業(yè)必須重視對(duì)沙門(mén)菌病的預(yù)防與控制。目前，沙門(mén)菌血清型數(shù)量超過(guò)2 600種，其中B群沙門(mén)菌最為復(fù)雜（超過(guò)100種），且在臨床樣品中具有較高的分離率[2]。

本研究從發(fā)病雛鵝體內(nèi)同時(shí)分離鑒定出2株同屬B群的沙門(mén)菌，分別為鼠傷寒沙門(mén)菌和印第安納沙門(mén)菌，通過(guò)藥敏試驗(yàn)和16S rDNA遺傳進(jìn)化分析，對(duì)分離菌的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，補(bǔ)充相關(guān)流行病學(xué)資料并為預(yù)防和控制鵝沙門(mén)菌病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2013年4月江蘇某肉鵝場(chǎng)飼養(yǎng)的雛鵝在22日齡開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病和死亡。病鵝主要表現(xiàn)為體形瘦小、精神委頓、食欲減少或廢絕、排水樣稀糞。剖檢病變主要表現(xiàn)為心包炎、漿膜炎、肝臟有白色結(jié)節(jié)、脾臟腫大、膽囊充盈等。無(wú)菌采集病死雛鵝臟器進(jìn)行病原分離與鑒定。

1.2 主要試劑 麥康凱瓊脂、XLD瓊脂、MH瓊脂，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母抽提物，購(gòu)自O(shè)XOID公司；腸桿菌科細(xì)菌生化管鑒定系統(tǒng)、藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；沙門(mén)菌屬診斷血清，購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；PCR相關(guān)試劑和16S rDNA細(xì)菌鑒定PCR試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)菌分離純化 剖檢病死雛鵝，無(wú)菌操作取心、肝、脾、膽囊、胰腺等病料分別接種于血瓊脂平板，于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落于麥康凱瓊脂、XLD瓊脂平板進(jìn)一步純化培養(yǎng)。

1.4 革蘭染色鏡檢 挑取純化培養(yǎng)后的單個(gè)菌落涂片，進(jìn)行革蘭染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。

1.5 生化試驗(yàn) 將純化后的分離菌接種腸桿菌科細(xì)菌生化反應(yīng)管，37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，與參考文獻(xiàn)[3]對(duì)照進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。

1.6 引物設(shè)計(jì)與PCR檢測(cè) 參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]根據(jù)沙門(mén)菌腸毒素stn基因設(shè)計(jì)引物，目的片段大小為260 bp，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物P1：5′-CTTTGGTCGTAAAATAAGGC G-3′；

下游引物P2：5′-TGCCCAAAGCAGAGAGATT C-3′。

以純化菌落為模板，PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃1 min、55℃1 min、72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 血清學(xué)鑒定 將分離菌純培養(yǎng)物按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.4-2010）[5]，利用沙門(mén)菌屬診斷血清進(jìn)一步鑒定血清型。

1.8 藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，從各類(lèi)抗菌藥物中選取18種常用抗菌藥物，對(duì)分離菌純培養(yǎng)物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參照其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.9 16S rDNA遺傳進(jìn)化分析 無(wú)菌挑取菌落至100 μL高壓DDW中，100℃煮沸10min，12 000 r/min離心2min，取5μL上清液作為模板，用16S rDNA細(xì)菌鑒定PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA 5μL，PCR預(yù)混液25μL，上、下游引物各0.5μL，16 s-free水19μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min、53℃1min、72℃1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank登錄的22株不同血清型沙門(mén)菌序列用DNAStar進(jìn)行比對(duì)，并用Clustalx1.83和MEGA 5.0軟件采用最大簡(jiǎn)約法（Maximum parsimony）繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)與染色鏡檢 病料接種麥康凱瓊脂平板后，長(zhǎng)出無(wú)色、半透明、表面光滑的圓形小菌落；接種XLD瓊脂平板后，發(fā)現(xiàn)2種疑似沙門(mén)菌菌落，一種表面光滑、透明、菌落偏大（編號(hào)1318），另一種為光滑、中心發(fā)黑的中等菌落（編號(hào)1319）。這2種菌落經(jīng)革藍(lán)染色后，在油鏡下觀察均為革蘭陰性小桿菌。

2.2 分離菌生化鑒定 通過(guò)生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這2個(gè)菌株均可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖和蔗糖，M.R.試驗(yàn)硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性，初步判定為沙門(mén)菌。

2.3 分離菌的PCR檢測(cè) 用沙門(mén)菌stn基因特異性引物對(duì)2株分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1。2個(gè)菌株擴(kuò)增的DNA片段約為260 bp，和預(yù)期片段大小一致，表明分離菌均為沙門(mén)菌。

2.4 血清學(xué)鑒定 血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)分離菌株均能與沙門(mén)菌A～F多價(jià)血清、O4和O12因子血清發(fā)生凝集；對(duì)其H抗原的檢測(cè)表明，1318菌株含有Hi和H2抗原，而1319菌株含有Hz和H7抗原。檢索卡夫曼-懷特沙門(mén)菌抗原表，鑒定1318菌株和1319菌株分別為B群的鼠傷寒沙門(mén)菌和印第安納沙門(mén)菌。

2.5 藥敏試驗(yàn) 分離菌對(duì)18種常用抗菌藥物的敏

圖1分離菌stn基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

感試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。2個(gè)分離株均為多重耐藥菌株，其中鼠傷寒沙門(mén)菌耐3種藥物（耐藥率16.7%），而印第安納沙門(mén)菌耐12種藥物（耐藥率66.7%）。2個(gè)分離株均對(duì)鏈霉素、呋喃唑酮、頭孢曲松鈉、多粘菌素B具有敏感性，臨床可用上述藥物進(jìn)行相關(guān)防控。

2.6分離菌遺傳進(jìn)化分析 對(duì)2個(gè)分離菌株16SrDNA前500 bp左右的保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定，結(jié)果擴(kuò)增條帶符合預(yù)期大?。ㄒ?jiàn)圖2）。將測(cè)序結(jié)果上傳至GenBank（登錄號(hào)：KF916571、KF916570），與22株不同血清型沙門(mén)菌16S rDNA序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析（圖3）。從進(jìn)化樹(shù)可以看出，各血清型沙門(mén)菌整體上分為兩大分支。本研究分離到的鼠傷寒沙門(mén)菌和印第安納沙門(mén)菌具有較高的同源性（99.1%）；分離株與大多數(shù)（18種）血清型具有相近的親緣性；而與雞白痢、雞傷寒、爪哇安納、海德?tīng)柋さ?個(gè)血清型的親緣性相對(duì)較遠(yuǎn)。

表1 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖2 分離菌16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 沙門(mén)菌代表血清型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

沙門(mén)菌病是嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)的一種重要的細(xì)菌性疾病，其抗原復(fù)雜，血清型眾多。Gong等[6]對(duì)我國(guó)2006-2012年分離的323株禽源沙門(mén)菌流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些菌株分屬6群20個(gè)血清型，以雞白痢、鼠傷寒和腸炎沙門(mén)菌為主要流行血清型。其中，鵝源沙門(mén)菌分離率最高的依次為鼠傷寒（11/66）、腸炎（10/66）、印第安納（10/66）和波茨坦（10/66）血清型。本研究從病死雛鵝體內(nèi)同時(shí)分離到2株沙門(mén)菌，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定為鼠傷寒沙門(mén)菌和印第安納沙門(mén)菌，表明這2種血清型在國(guó)內(nèi)具有較高的流行性。研究揭示，我國(guó)鵝群沙門(mén)菌感染較為復(fù)雜，單一甚至多血清型沙門(mén)菌同時(shí)感染十分普遍，應(yīng)該引起獸醫(yī)工作者的重視，采取相應(yīng)措施進(jìn)行有效防控。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)分離株均為多重耐藥菌株，雖然同屬B群沙門(mén)菌且分離自同一宿主，但其耐藥性卻有較大差異。其中鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥率相對(duì)低（16.7%），而印第安納沙門(mén)菌耐藥率則較高（66.7%）。鼠傷寒沙門(mén)菌僅對(duì)復(fù)方新諾明、阿奇霉素和利福平耐藥，對(duì)臨床常用的喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)藥物均很敏感，這與近年來(lái)報(bào)道[7-8]的禽源鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥性差別較大。國(guó)內(nèi)對(duì)印第安納沙門(mén)菌的研究相對(duì)較少，陸彥等[9-10]對(duì)雞源印第安納沙門(mén)菌的耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，所分離的菌株對(duì)喹諾酮類(lèi)和氯霉素類(lèi)藥物普遍耐藥。本研究分離的鵝源印第安納沙門(mén)菌不僅對(duì)喹諾酮類(lèi)、氯霉素類(lèi)藥物耐藥，對(duì)四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)及部分氨基糖胺類(lèi)藥物均表現(xiàn)為耐藥。分析表明，鵝群散養(yǎng)環(huán)境的復(fù)雜性以及飼養(yǎng)過(guò)程中藥物使用不當(dāng)可能導(dǎo)致了沙門(mén)菌耐藥性提升。對(duì)耐藥基因的檢測(cè)有助于分析這2菌株的耐藥性差異。同時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，可使用硝基呋喃類(lèi)、頭孢類(lèi)或多肽類(lèi)藥物進(jìn)行治療與防控。

本研究對(duì)2個(gè)分離菌株的16S rDNA進(jìn)行序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，2個(gè)不同血清型的沙門(mén)菌具有較高的同源性。與GenBank中的22個(gè)不同血清型沙門(mén)菌的序列比對(duì)結(jié)果顯示，本研究分離的2個(gè)菌株與雞沙門(mén)菌感染密切相關(guān)的雞白痢、雞傷寒、爪哇安納、海德?tīng)柋さ妊逍陀H緣性相對(duì)較遠(yuǎn)，而與其他泛嗜性血清型具有較高的親緣關(guān)系，確定了其遺傳進(jìn)化地位，為進(jìn)一步開(kāi)展病原分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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