何海健，劉曉東，馬 濤，姜正前，蔣春燕，張超穎

（1.浙江金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華321007；2.青島易邦生物科技有限公司，山東 青島266032；3.浙江同點(diǎn)生物科技有限公司，浙江 杭州310004）

關(guān)節(jié)腫脹是保育豬的常見疾病，而且常常伴隨發(fā)生敗血性疾病或者腦炎，為豬場造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。引起關(guān)節(jié)腫脹的疾病很多，包括豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬丹毒桿菌、支原體等，但目前常見的病原仍是豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌[2]。從臨床癥狀上很難將這2種疾病區(qū)分開來，必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷予以確診。本文是在發(fā)生關(guān)節(jié)腫脹的病死豬中，同時(shí)從關(guān)節(jié)和肺臟中進(jìn)行細(xì)菌的分離，比較不同細(xì)菌的分離率，并分析這兩種細(xì)菌在豬體內(nèi)的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 病料來源 從浙江的幾個(gè)豬場中采集，這幾個(gè)豬場的保育仔豬均出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，并伴隨敗血性疾病或者腦炎、呼吸道癥狀。

1.2 材料 HPS標(biāo)準(zhǔn)菌株：由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室惠贈(zèng)；TSA與TSB培養(yǎng)基，購自杭州天和微生物試劑有限公司；Taq酶等PCR反應(yīng)試劑，購自TaKaRa公司。

1.3 細(xì)菌分離 參考尹秀鳳等[10]的副豬嗜血桿菌及戴金玲等[11]的鏈球菌分離方法，用接種環(huán)挑取肺臟黏液或者關(guān)節(jié)液，劃線于含5%牛血清及0.1%NAD的TSA平板上，37℃培養(yǎng)16～24 h后，挑取單菌落于含5%牛血清及0.1%NAD的TSB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)菌的鑒定

1.4.1 模板的提取 取100μL菌液或者關(guān)節(jié)稀釋液煮沸10min，離心后取上清作為PCR模板，利用PCR方法對細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.4.2 副豬嗜血桿菌的PCR鑒定 PCR反應(yīng)引物[2]見表1，PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×Buffer 2.5μL，25mmol／LMgCl20.5μL，2μmol/L dNTPs 0.5μL，20μmol/L上、下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，無菌水19μL，模板1μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測序并與NCBI上發(fā)布的副豬嗜血桿菌16S基因序列進(jìn)行比對，進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。

1.4.3 豬鏈球菌的PCR鑒定 PCR反應(yīng)引物[3]見表1，PCR反應(yīng)體系(25μL)：10×Buffer2.5μL，25mmol／LMgCl20.5μL，2μmol/L dNTPs0.5μL，20μmol/L上、下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，無菌水19μL，模板1μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測序并與NCBI上發(fā)布的豬鏈球菌GDH基因序列進(jìn)行比對，進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。

1.4.4 豬鏈球菌的分型鑒定 PCR分型引物根據(jù)NCBI上發(fā)布的豬鏈球菌cps序列，并參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[3-5]，引物如表1。

表1 細(xì)菌鑒定、分型引物序列

PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×Buffer 2.5μL，25 mmol／LMgCl20.5μL，2μmol/L dNTPs 0.5μL，20 μmol/L GDH及cps1、2、7、9上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，無菌水補(bǔ)齊24μL，模板1μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測序并與NCBI上發(fā)布的豬鏈球菌cps基因序列進(jìn)行比對，進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。

1.5 小鼠致病性試驗(yàn) 將培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌CFU計(jì)數(shù)后，離心，調(diào)整為1010CFU/mL。將25只昆明系小鼠隨機(jī)分為5組，每組5只，其中1組作為陰性對照，其他4組分別攻毒4株副豬嗜血桿菌，每只小鼠攻毒0.2mL。將死亡的小鼠剖檢后，對小鼠重新進(jìn)行細(xì)菌分離，檢測死亡小鼠的副豬嗜血桿菌分離率。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的PCR結(jié)果 按照上述PCR反應(yīng)引物及反應(yīng)體系，可擴(kuò)增出相應(yīng)片段大小的PCR產(chǎn)物，將所有的PCR產(chǎn)物測序并比對后，序列同源性均超過97%，證明所分得的細(xì)菌為副豬嗜血桿菌或者豬鏈球菌。

2.2 細(xì)菌的分離結(jié)果 見表2。

2.3 關(guān)節(jié)液PCR檢測結(jié)果 見表3。

表2 細(xì)菌的分離結(jié)果

表3 關(guān)節(jié)液的PCR鑒定結(jié)果

從表3中可以看出，關(guān)節(jié)液的PCR結(jié)果與細(xì)菌的分離結(jié)果大體相似，僅在病料8中出現(xiàn)一定的偏差，懷疑可能保存不當(dāng)或者因吞噬細(xì)胞導(dǎo)致菌體崩解。

2.4 小鼠致病性試驗(yàn) 見表4。

所有死亡的小鼠死亡時(shí)間均在84 h內(nèi)，84 h后，所有存活的小鼠耐過。在所有死亡的小鼠體內(nèi)，均重新分離到了HPS。

表4 副豬嗜血桿菌的小鼠致死率

3 討論

我們分離的病料中，并不是所有的豬都存在呼吸道癥狀，但幾乎在所有的肺臟中，我們都分離到了細(xì)菌。雖然副豬嗜血桿菌是一種條件性致病菌，同時(shí)也是呼吸道常在菌，但非致病時(shí)，其定居在上呼吸道中，而在肺臟中是不存在的，所以肺臟中分離到的副豬嗜血桿菌，我們懷疑其為致病菌。接著通過小鼠攻毒試驗(yàn)證明其存在致病性。

在歐洲，導(dǎo)致豬發(fā)生豬鏈球菌病以R群的2型豬鏈球菌為主，其次是1型、9型和7型[6]。從結(jié)果中看出，相對副豬嗜血桿菌，鏈球菌較易從關(guān)節(jié)中分離到，而關(guān)節(jié)中副豬嗜血桿菌的分離率很低，這與張玉玉等人得到的結(jié)論一致[7]。后來我們用大量的關(guān)節(jié)液涂布平板，仍然很難見到副豬嗜血桿菌。如果我們假設(shè)，引起關(guān)節(jié)腫脹的疾病與引起呼吸道疾病為同一種病原所致，那么我們有理由懷疑，在副豬嗜血桿菌引起的關(guān)節(jié)腫脹中，關(guān)節(jié)內(nèi)不一定會(huì)有菌體的存在，關(guān)節(jié)腫脹或許由相關(guān)毒素引起，或者也有可能由其他致病性因素引起。

從研究中可以看出，在這些病料中，2型和7型發(fā)病比例較高。在分離到豬鏈球菌的6份病料中，肺臟和關(guān)節(jié)也不是一一對應(yīng)的關(guān)系，無論是分離率還是鏈球菌的血清型；在一份病料中，我們從肺臟中分離到了2、7型鏈球菌，但在關(guān)節(jié)中僅分離到了2型，而在另一份病料中，我們在肺臟和關(guān)節(jié)中也分離到了不同血清型的鏈球菌。因此，在一頭豬體內(nèi)，可能存在多個(gè)血清型的鏈球菌，引起呼吸道癥狀或者敗血癥狀的鏈球菌，與關(guān)節(jié)腫脹的鏈球菌可能不是同一個(gè)菌株甚至血清型。不同菌株甚至不同種血清型的鏈球菌的同時(shí)存在，無疑為鏈球菌的防治提高了難度。

同時(shí)，我們從關(guān)節(jié)分離到的鏈球菌中，7型的分離比例相對較高。這可能與7型鏈球菌的靶器官嗜性相關(guān)，也可能跟鏈球菌在不同地區(qū)的不同流行性有關(guān)[8-9]。

[1] 蔡寶祥.家畜傳染病[M].4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

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