向暉，潘曉麗，熊永愛(ài)，張仕瑾，譚玉柱，董小萍

·藥理毒理·

大黃酸金屬配合物的結(jié)構(gòu)及對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

向暉，潘曉麗，熊永愛(ài)，張仕瑾，譚玉柱，董小萍

目的：以大黃酸和相應(yīng)金屬鹽為原料，合成3種金屬配合物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，比較其抗癌活性大小。方法：采用核磁共振氫譜法、紅外光譜法、紫外光譜法、滴定法、原子吸收光譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；采用MTT法測(cè)試三種配合物對(duì)于人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果：通過(guò)光譜法證實(shí)有配合物生成，并推測(cè)出其可能結(jié)構(gòu)。MTT測(cè)試顯示配合物和配體均具有一定的抗癌活性，其中大黃酸-Fe（Ⅲ）抗癌活性最強(qiáng)，其IC50值達(dá)17.44 μg．mL-1，優(yōu)于配體大黃酸（IC50= 116.741 μg．mL-1），大黃酸-Cu(Ⅱ)（IC50=54.427 μg．mL-1），大黃酸-Cr（Ⅲ）（IC50=63.584 μg．mL-1）。結(jié)論：大黃酸金屬配合物抗癌活性相比配體增強(qiáng)。

大黃酸；金屬配合物；HepG2細(xì)胞；抗癌

肝癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展較為隱匿，往往到了中晚期患者才能察覺(jué)[1]，該病死亡率高，患者痛苦大。而目前許多藥物抗癌活性并不理想，且部分藥物副作用大，針對(duì)性不強(qiáng)，故尋找新型抗癌藥物具有十分重要的意義。大黃酸來(lái)源于中藥大黃、虎杖等，屬于單蒽核類1,8—二羥基蒽醌衍生物[2]。大黃酸具有抗癌活性[3]。而作為金屬配合物的順鉑是臨床上一種重要的抗癌藥物，它作為聯(lián)合化療的基礎(chǔ)在多種疾病中表現(xiàn)出了極為優(yōu)秀的抗腫瘤效果[4]。大黃酸（見(jiàn)圖1）的1,8位羥基和9位羰基適于與金屬離子配位。許多文獻(xiàn)報(bào)道配合物的生物活性優(yōu)于配體，如木犀草素形成鋅配合物后其對(duì)抗DPPH自由基的能力增強(qiáng)[5]，再如大黃素形成銅(Ⅱ)配合物后，其抑菌活性有一定程度提高[6]。大黃酸金屬配合物的抗癌活性鮮有報(bào)道。MTT法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，被廣泛用于抗腫瘤藥物的篩選[7]，本實(shí)驗(yàn)選擇3種人體必需的微量的金屬元素鐵、銅、鉻，與大黃酸形成配合物，采用紅外光譜法、紫外光譜法、核磁共振氫譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。采用MTT法進(jìn)行活性篩選，找出其中抗癌活性相對(duì)優(yōu)秀的配合物，以期對(duì)進(jìn)一步研究和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

圖1 大黃酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 試劑

大黃酸（成都康邦生物生物科技有限公司，純度大于98%，批號(hào)20121101）；DMEM培養(yǎng)基（Hyclone,批號(hào)NYF0887)；青鏈霉素混合液（北京索萊寶生物科技，批號(hào)20121009）；胰蛋白酶（北京索萊寶生物科技，批號(hào)20130626）；胎牛血清（北京平睿生物科技，批號(hào)20130129）；MTT（sigma,M2128)；PBS緩沖鹽（北京索萊寶科技，批號(hào)P1022）；順鉑（山東齊魯制藥，批號(hào)0040112DB），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞

人肝癌HepG2細(xì)胞由成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.3 儀器設(shè)備

紅外光譜采用BRUKER Tensor-27型傅立葉變換中紅外光譜儀測(cè)定；UV-1700型紫外分光光度計(jì)；核磁共振氫譜采用BRUKER AM-400型超導(dǎo)核磁共振儀（DMSO-d6作溶劑測(cè)定）；原子吸收光譜法采用contrAA 300原子吸收光譜儀，PHB-8型pH計(jì)；二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC，三洋電機(jī)株式會(huì)社）；雙人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺(tái)（SW-SJ-2D，中國(guó)蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（UPH-Ⅱ-10T，成都超純科技有限公司）；BP211D型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司）。

2 方法

2.1 大黃酸金屬配合物的合成

稱取0.5 mmol 大黃酸，以40 mL無(wú)水乙醇溶解，加入0.25 mmol 相應(yīng)金屬鹽（Cr(NO3)3?6H2O，F(xiàn)e?6H2O，CuCI2?6H2O）的10 mL 無(wú)水乙醇溶液，逐滴加入氨水的乙醇溶液(1∶1, V∶V)，調(diào)節(jié)配體溶液的pH 值為8～9, 溶液有紫紅色沉淀生成，以38℃攪拌反應(yīng)12 h， 將溶液靜置后離心取沉淀，依次用無(wú)水乙醇，乙醚分別將沉淀洗滌數(shù)次后，在40℃下真空干燥72 h, 得粉末狀固體產(chǎn)物。

2.2 配合物中金屬元素含量測(cè)定

2.2.1 碘量法（Cu、Fe（Ⅲ）元素含量測(cè)定）

（1）滴定液的配制 取硫代硫酸鈉26 g，與無(wú)水碳酸鈉0.2 g，加入煮沸后的冷水溶解并稀釋到1000 mL，搖勻，放置1個(gè)月后過(guò)濾。

（2）滴定液的標(biāo)定 參照中國(guó)藥典2010版第二部附錄XV項(xiàng)下滴定液的配制和標(biāo)定。取120℃下干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀0.15 g，加水50 mL 使之溶解，加碘化鉀2 g，溶解后加稀硫酸40 mL搖勻，密閉。在暗處放置10 min后加水250 mL稀釋。以滴定液滴定至終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液3 mL，至藍(lán)色消失而顯示綠色，并作空白矯正。將所得滴定液稀釋十倍即得0.01 mol．L-1的硫代硫酸鈉。

（3）配合物的滴定 稱取配合物60 mg，在700°C馬弗爐中灼燒至恒重得金屬氧化物粉末，以稀硫酸溶解，加水50 mL，加碘化鉀2 g，搖勻，密閉。用標(biāo)定好的硫代硫酸鈉溶液滴定，接近終點(diǎn)時(shí)滴加淀粉指示劑顯蘭色，再滴加至蘭色消失，記下體積數(shù)。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

以上實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定三次

2.2.2 原子吸收光譜法（Cr（Ⅲ）元素含量測(cè)定） 以12 mL HNO3(65%)，3 mLHCIO4將配合物溶解，放置24 h后，加熱使酸揮發(fā)至2 mL，以水稀釋至25 mL， 取稀釋后的溶液進(jìn)行測(cè)定，以菠菜標(biāo)準(zhǔn)品里金屬元素鉻含量為對(duì)照，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。

2.3 細(xì)胞系和培養(yǎng)條件

細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2，濕度飽和的條件下培養(yǎng)，每隔三天傳代一次。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.4 藥物配制

將大黃酸、大黃酸配合物、陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑分別用含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，使其最終濃度均達(dá)到100、50、25、12.5 μg．mL-1。以0.22 μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾除菌，備用。

2.5 抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)

將HepG2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，以含胎牛血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞配制成濃度為5×104/mL的混懸液，每孔160 μg接種于96孔板，在孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入上述配置好的含藥培養(yǎng)基160 μL，每個(gè)劑量設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞在含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，加入無(wú)血清高糖培養(yǎng)基160 μL以及MTT20 μL(5 mg．mL-1)，繼續(xù)在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入160 μL DMSO，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定各孔吸光值。計(jì)算抑制率，將配合物對(duì)細(xì)胞抑制率與配體對(duì)細(xì)胞的抑制率做比較。

細(xì)胞抑制率計(jì)算公式：抑制率=1-加藥組A值/對(duì)照組A值×100%

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 配合物外觀及一般性質(zhì)

配合物外觀與配體相比較發(fā)生了明顯變化。鐵和鉻的配合物均呈現(xiàn)較深的紫紅色，銅配合物呈現(xiàn)深黃色，且質(zhì)地變硬，熔點(diǎn)明顯增高。將配合物在700℃高溫下灼燒至恒重可以得到金屬氧化物粉末。配合物難溶于水、氯仿、乙醚、丙酮，石油醚等試劑，但較易溶解在DMSO（二甲基亞砜）、DMF（二甲基甲酰胺）等堿性試劑中。

3.2 紫外光譜

將大黃酸和大黃酸配合物配制成0.5×10-4mol．L-1的甲醇溶液，在200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)表1。由數(shù)據(jù)可見(jiàn)，大黃酸配合物峰形與大黃酸基本一致，說(shuō)明保留了其中的蒽醌基本結(jié)構(gòu)。大黃酸在229、257、431處出現(xiàn)3個(gè)比較強(qiáng)的吸收帶，分別由苯樣結(jié)構(gòu)、醌樣結(jié)構(gòu)以及蒽醌中的羰基引起，配合物仍然具有三個(gè)基本吸收峰，但大黃酸配合物吸收峰發(fā)生紅移且強(qiáng)度增加。配合物在500 nm以上處出現(xiàn)一新的弱吸收峰，可能原因是羰基與與金屬離子配位，分子內(nèi)電子離域程度增加造成的。

表1 大黃酸及其配合物的UV圖譜數(shù)據(jù)

3.3 紅外光譜

紅外光譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。與配體大黃酸相比較，配合物均在3425左右處有一寬峰，表明存在結(jié)晶水。配體大黃酸在3060處有一分子內(nèi)氫鍵的吸收峰，而配合物中此吸收減弱或消失，表明配位后分子內(nèi)氫鍵被破壞。羰基吸收峰發(fā)生了小幅度紅移，并且吸收強(qiáng)度減弱，說(shuō)明羰基參與配位。配體和配合物酚羥基中碳氧鍵都存在強(qiáng)吸收，但配合物的吸收峰顯著弱于配體，說(shuō)明酚羥基參與配位。同時(shí)配合物在511處出現(xiàn)了M-O伸縮振動(dòng)。

表2 配體和配合物紅外光譜IR(cm-1)數(shù)據(jù)

3.4 核磁共振氫譜

核磁共振氫譜以二甲基亞砜為溶劑，結(jié)果顯示配合物和大黃酸相比，其核磁共振氫譜發(fā)生了明顯變化，其中大黃酸δ：13.73(s,1H),11.89（s,2H),8.12 (d,J=4.0Hz,1H),7.84(t,J=8.0Hz,1H),7.75(d,J=1.2Hz,1H ),7.73(d,J=4.0Hz,1H),7.41(d,J=8.0Hz,1H)；大黃酸-銅(Ⅱ)δ：8.09（s，1H)，7.28～7.48(m,5H)，7.70～7.83（m，4H)，10.5～13.3（m，4H)；大黃酸-鉻（Ⅲ) δ：8.3～9.7（m，4H)，6.8～8.3(m,10H)；由于溶解性或其他原因，未得到清晰的大黃酸-鐵（Ⅲ) 氫譜。從已測(cè)得的氫譜上看，配合物中氫個(gè)數(shù)加倍，多出現(xiàn)重峰。羰基兩旁的羥基上均有孤對(duì)電子，均有通過(guò)羰基和金屬離子形成配合物的可能。但羧基具有吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)，所以離羧基較近的羥基上的氫更活潑，故1位羥基失去一個(gè)質(zhì)子，通過(guò)羰基和金屬離子形成配合物。

3.5 金屬元素含量測(cè)試結(jié)果

含量測(cè)試結(jié)果現(xiàn)實(shí)，基本符合兩分子配體與一個(gè)金屬離子配位的推測(cè)。

表3 金屬元素含量測(cè)定結(jié)果

由結(jié)構(gòu)表征分析，分析大黃酸金屬配合物可能結(jié)構(gòu)式為：兩分子大黃酸和一分子金屬離子通過(guò)大黃酸的1位羥基和9位羰基形成金屬配合物。

圖2 大黃酸金屬配合物可能結(jié)構(gòu)

3.6 配合物抗癌活性測(cè)試結(jié)果

順鉑是對(duì)HepG2具有抑制作用[8]，作為本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照。配合物、配體以及陽(yáng)性對(duì)照藥物在12.5～100 μg．L-1的濃度范圍內(nèi)均對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生一定抑制作用，且隨著藥物濃度增加抑制率增加。方差分析顯示，用藥組與空白組相比P＜0.05，表明差異顯著。但不同金屬離子的配合物對(duì)癌細(xì)胞作用強(qiáng)度存在差異。根據(jù)吸光值按照上述公式計(jì)算抑制率，見(jiàn)表1，再以spss軟件計(jì)算IC50值。配體和配合物IC50值依次為大黃酸（116.741）；大黃酸-Cu(Ⅱ)（54.427）；大黃酸-Cr（Ⅲ）（63.584）；大黃酸-Fe（Ⅲ）（17.44）；；由IC50值可知，大黃酸-Fe（Ⅲ）具有較強(qiáng)的抗癌活性，但低于順鉑。且金屬配合物抗癌活性基本高于配體大黃酸。金屬配合物、配體抗癌活性大小順序?yàn)椋?/p>

大黃酸-Fe（Ⅲ）＞大黃酸-Cu(Ⅱ)≈大黃酸-Cr＞大黃酸

表4 大黃酸金屬配合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞作用48 h增殖的影響

4 結(jié)論

肝癌是一種十分常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康。大黃酸本身具有抗癌作用，文獻(xiàn)報(bào)道其可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)從而誘導(dǎo)其凋亡[9]。雖然順鉑顯示出較強(qiáng)的抗癌活性，但它具有腎毒性，耳毒性，以及神經(jīng)毒性使其臨床應(yīng)用受到限制[10]。天然成分的優(yōu)勢(shì)就在于毒副作用相對(duì)較小。中藥配位學(xué)說(shuō)認(rèn)為中藥有效成分是有機(jī)成分和金屬離子形成的配合物[11]。而初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃酸金屬配合物的抗癌活性相對(duì)于配體有一定程度提高，配體和金屬離子之間對(duì)抑制HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較IC50值，篩選出來(lái)抗癌活性最優(yōu)的大黃酸金屬配合物。本實(shí)驗(yàn)顯示金屬配合物在抗癌方面具有十分良好的開發(fā)前景，為探索治療肝癌新藥物提供了初步的依據(jù)。但大黃酸金屬配合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制是否相同于大黃酸，尚需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

The study on structure and inhibiting capacity of Rhein metal complex on human live tumor HepG2 cell proliferation

XIANG Hui, PAN Xiao-li, XIONG Yong-ai, ZHANG Shi-jin, TAN Yu-zhu, DONG Xiao-ping//(Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:Synthesize three Rhein metal complex and represent the structure, then compare the antitumor activity.Method:The structures of the metal complex were studied using H-NRM spectroscopy, infrared spectroscopy, ultraviolet spectroscopy, titration and Atomic Absorption Spectroscopy. And MTT test was used to study the antitumor activity on HepG2 cell.Result:The metal complex generation was confrmed through the structural characterization which suggested that the complex was constituted by Rhein molecular and one metal ion. The results of MTT test showed that rhein and the metal complex both had antitumor activity. Rhein-Fe（Ⅲ） had the strongest antitumor activity with the IC50of 17.44 μg．mL-1. And the IC50value of Rhein , Rhein-Cu(Ⅱ), and Rhein -Cr（Ⅲ）was 116.74 μg．mL-1, 54.427 μg．mL-1and 63.584 μg．mL-1respectively.Conclusion:Rhein metal complexe has a stronger antitumor activity than the ligand.

Rhein; metal complex; HepG2 cell; Antitumor activity

R 285.5

A

1674-926X(2014)05-011-04

四川省教育廳資助項(xiàng)目（13ZB0302）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

向暉，在讀研究生Email:xianghui12688@126.com

董小萍，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥及其復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Email:dongxiaoping11@126.com

2014-03-03