華碧春，劉嬌，黃智鋒，史道華，廖華軍，林芳

·藥理毒理·

黃藥子配伍甘草對大鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)影響的實驗研究

華碧春1，劉嬌1，黃智鋒1，史道華2，廖華軍1，林芳3

目的：研究黃藥子和黃藥子配伍甘草后對大鼠肝臟組織CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)的影響。方法：將24只雄性SD大鼠分為3組，分別給藥28天，采用HE染色觀察肝組織病理損傷，免疫組化法檢測大鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果：黃藥子與甘草配伍能夠改善大鼠肝臟組織病變；與對照組比較，黃藥子組肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白的陽性表達(dá)指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與黃藥子組比較，配伍組肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白的陽性表達(dá)指數(shù)降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：甘草能對抗黃藥子導(dǎo)致的肝損傷，其減毒機(jī)理可能與抑制肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)有關(guān)。

黃藥子；配伍；甘草；免疫組化；CYP1A2；CYP2E1

黃藥子(Rhizoma Dioscoreae)為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨(Dioscorea bulbifera L.)的塊莖[1]。性味苦、辛、涼，有解毒消腫、化痰散結(jié)、涼血止血的功效。隨著黃藥子在臨床應(yīng)用的增加，其臨床不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為對肝臟和腎臟的損害[2]。本課題前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃藥子配伍甘草后可減輕黃藥子肝損傷作用[3～5]。另有研究表明：藥物性肝損傷的發(fā)生與肝組織內(nèi)CYP450的活性水平有密切關(guān)系[6]。故本研究采用免疫組化技術(shù)分析黃藥子及黃藥子配伍甘草對大鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)的影響，以期了解甘草與黃藥子配伍的減毒機(jī)理，為臨床安全、合理使用黃藥子提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品及試劑

黃藥子（批號120724）、甘草（批號12030506），購于福建回春醫(yī)藥連鎖有限公司，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為薯蕷科植物黃獨Dioscorea bulbifera L.的干燥塊莖與豆科植物脹果甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖。CYP1A2抗體(貨號：ab22717)、CYP2E1抗體(貨號：ab19140)購自abcam公司、DAB染色液（鏈霉菌-生物素法）購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物

雄性SD大鼠，體重180～200 g，SPF級，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.3 儀器

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、TDL80-2B臺式離心機(jī)、PYX-DHS-4X50隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、ZT-14S（雙吊籃）生物組織自動脫水機(jī)、YB-6LF生物組織石蠟包埋機(jī)、LEICA2235切片機(jī)、HFsafe生物安全柜、DM4000B生物顯微鏡。

2 實驗方法

2.1 藥液制備

黃藥子飲片適量，加入8倍量水浸泡60 min，煎煮，煮沸60 min，藥液過濾，藥渣再加入5倍量水，煮沸30 min，合并濾液，濃縮至每毫升相當(dāng)于1 g生藥，用時稀釋至所需濃度；取黃藥子、甘草飲片（1:2），如上法制備，濃縮至每毫升相當(dāng)于原藥材1 g（生藥含量以黃藥子計），用時稀釋至所需濃度。

2.2 動物分組、給藥

健康SPF級雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組，黃藥子組、黃藥子配伍甘草組(后文簡稱“配伍組”)、對照組，每組8只。黃藥子組每日給予黃藥子水煎劑9 g．kg-1（相當(dāng)于常人最大日用量10倍），配伍組給予27 g．kg-1配伍藥液，對照組給予同體積蒸餾水，連續(xù)給藥28天。

2.3 肝組織病理學(xué)檢測

大鼠禁食12 h，經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉，取適量肝臟組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定，通過石蠟包埋，制成蠟塊。置切片機(jī)進(jìn)行切片，組織切片厚度4 μm，常規(guī)脫蠟水化，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染后光鏡檢查。

2.4 免疫組化法檢測肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)

采用免疫組化SP法染色，石蠟組織切片經(jīng)抗原修復(fù)，加入相應(yīng)第一抗體CYP1A2 ( 1:100) 、CYP2E1( 1:200)，加入第二抗體，DAB顯色后檢測蛋白表達(dá)量變化。

結(jié)果判斷：采用雙盲法觀察切片，每個標(biāo)本取5個較好的高倍視野（10×40），按顯色范圍分為：①+：顯色范圍占視野＜1/4；②++：顯色占視野1/4～2/4；③+++：顯色占視野2/4～3/4；④++++：顯色占視野＞3/4；顯色程度分弱、中、強(qiáng)，用+、++、+++表示(其中+為1、++為2、+++為3、++++為4)。取其均數(shù)為每個檢測指標(biāo)的最終顯色指數(shù)（顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍）。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠肝臟組織病理學(xué)改變

光鏡下觀察對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞排列規(guī)則、整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，未見壞死、變性。黃藥子組肝細(xì)胞索排列絮亂，肝細(xì)胞若干有明顯腫脹，部分細(xì)胞質(zhì)疏松。配伍組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，基本接近對照組。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)比較

3.2 對肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)的影響

大鼠給予黃藥子藥液后，CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，與對照組比較有非常顯著差異（P＜0.01）；甘草與黃藥子配伍后能夠抑制CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)，與黃藥子組比較有非常顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。表明甘草具有一定的減毒作用。見表1、圖2。

表1 給藥各組對大鼠肝組織CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)顯色指數(shù)的比較()

表1 給藥各組對大鼠肝組織CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)顯色指數(shù)的比較()

注：與對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與黃藥子組比較，ΔP＜0．05，ΔΔP＜0．01

組別 動物數(shù) CYP1A2 CYP2E1黃藥子組 8 5.74±1.55Δ8.03±2.57**配伍組 7 5.74±1.55Δ4.09±1.18ΔΔ對照組 7 1.86±0.34 1.29±0.32

圖 2 各組大鼠肝組織CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)情況

4 討論

CYP酶分布廣泛，但主要存在于肝微粒體，參與各種內(nèi)源性、外源性化合物在體內(nèi)的代謝過程[7]。同時在藥物的消除過程中起著非常重要的作用，同時也是引起聯(lián)合用藥時藥物相互作用產(chǎn)生的主要因素[8]。CYP450家族有多種同工酶，與藥物代謝密切相關(guān)有CYP1，CYP2，CYP3三個基因家族。在肝臟中，CYP1A2的含量占CYP450蛋白總量的13%，在藥物代謝、前致癌物激活的過程中均起著重要的作用，它的活性與許多藥物的療效或毒性以及一些腫瘤的易感性密切相關(guān)[9]；CYP2E1占CYP450蛋白總量的7%，該酶僅在肝中表達(dá)，可以認(rèn)為是肝的特異性功能酶，它能夠活化前致癌物和毒物，并與肝毒性的發(fā)生密切相關(guān)[10]。CYP1A2、CYP2E1是CYP450酶系中重要的兩個亞型，具有重要藥物毒理學(xué)意義。

有文獻(xiàn)報道：蛋白表達(dá)譜變化可能與肝損傷制相關(guān)[11]。本實驗采用免疫組化技術(shù)檢測CYP1A2、 CYP2E1蛋白表達(dá)情況，探討黃藥子配伍甘草的減毒機(jī)制。本實驗結(jié)果表明：黃藥子組CYP1A2、CYP2E1蛋白表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)，配伍甘草后其表達(dá)降低。說明甘草的減毒機(jī)制之一可能與其抑制CYP1A2、CYP2E1表達(dá)有關(guān)。肝損傷的發(fā)生與質(zhì)膜損害、自由基損害、線粒體功能失調(diào)、代謝紊亂、細(xì)胞內(nèi)離子濃度改變、細(xì)胞因子、一氧化氮、免疫變態(tài)反應(yīng)、細(xì)胞調(diào)亡等有關(guān)[12～13]。甘草配伍黃藥子僅通過抑制CYP酶表達(dá)減輕毒性作用，還是可能通過更多途徑影響黃藥子對肝臟的毒性作用尚待進(jìn)一步探討，對深入研究甘草配伍黃藥子的減毒機(jī)制有著重要意義。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

Experimental study on CYP1A2 and CYP2E1 protein expression in liver of rats by combined administration of Huangyaozi and Gancao

HUA Bi-chun1, LIU Jiao1, HUANG Zhi-feng1, SHI Dao-hua2, LIAO Hua-jun1, LIN Fang3//(1.College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuiian 350122, China; 2.Fujian Provincial Maternal and Child Health Hospital, Fuiian 350001,China;3.Longxi Hospital of Traditional Chinese Medicine, Dingxi 748100, Gansu )

Objective:To study the effects of Huangyaozi used alone and combined with Gancao on the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in rats.Method:24 SD rats were randomized into 3 groups. After 28 days of administration of drugs respectively, the pathological alterations were observed after HE staining, and the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in rats were detected by immunohistochemistry.Result:The compatibility of Huangyaozi and Gancao can amend the liver tissue of rats with lesions. Compared with the control group, the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in the Huangyaozi group were signifcantly increased (P＜0.01).Compared with the Huangyaozi Group, the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in the combination group were decreased (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion:Gancao can lower the hepatic injury induced by Huangyaozi. The mechanism may be related to the inhibition of CYP1A2 and CYP2E1 protein expression.

Huangyaozi; combination; Gancao; immunohistochemical; CYP1A2; CYP2E1

R 285.5

A

1674-926X(2014)05-010-03

國家自然科學(xué)基金課題（81274105）

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 福建 福州，350122；2.福建省婦幼保健院，福建 福州，350001；3.甘肅省隴西縣中醫(yī)院，甘肅 定西，748100

華碧春（1962～），女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥學(xué)研究 Email:1625399195@qq.com

2014-02-25