周 鳳張晉昕唐小江

利用SPSS軟件中M ixed model模塊處理致畸試驗(yàn)中窩別效應(yīng)

周 鳳1，2張晉昕1，△唐小江2

目的探討致畸試驗(yàn)中由于窩別效應(yīng)存在時(shí)，如何利用SPSS軟件正確地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。方法本文運(yùn)用SPSS 20.0軟件分別采用傳統(tǒng)分析方法（忽略窩別效應(yīng)的t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)、窩平均法）與多水平模型處理致畸試驗(yàn)中窩別效應(yīng)，其中包括定量變量及定性變量的統(tǒng)計(jì)分析，并比較其結(jié)果。結(jié)果傳統(tǒng)分析方法（t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)）未考慮窩別效應(yīng)的存在，會(huì)增加犯假陽(yáng)性錯(cuò)誤的概率；窩平均法可損失樣本的大量信息，會(huì)增加犯假陰性錯(cuò)誤的概率；多水平模型考慮原始數(shù)據(jù)的內(nèi)在結(jié)構(gòu)，可有效處理具有層次結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)。結(jié)論多水平模型可正確處理窩別效應(yīng)，且SPSS軟件中M ixed model過(guò)程操作簡(jiǎn)單，易于掌握。

致畸試驗(yàn) 窩別效應(yīng) 多水平模型 SPSS

致畸試驗(yàn)又稱胚體-胎體毒性試驗(yàn)，是三段生殖毒性試驗(yàn)中的第Ⅱ階段，它通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)母體自胚泡著床到硬腭閉合期間接觸受試物對(duì)妊娠雌體及胚胎-胎體發(fā)育的影響［1］。我國(guó)主管部門和有關(guān)管理機(jī)構(gòu)已把致畸試驗(yàn)列為食品添加劑、保健食品、農(nóng)藥、新藥、化妝品以及首次進(jìn)口化學(xué)品的安全性評(píng)價(jià)程序中不可或缺的項(xiàng)目［2］。

由于遺傳因素、宮內(nèi)發(fā)育環(huán)境、致畸物的代謝環(huán)境等的相似性，導(dǎo)致了同窩胎仔之間的非獨(dú)立性，即存在窩別效應(yīng)，統(tǒng)計(jì)分析中應(yīng)考慮這個(gè)效應(yīng)。研究者如果不能對(duì)仔體數(shù)據(jù)進(jìn)行正確的統(tǒng)計(jì)分析，就可能導(dǎo)致得出有偏甚至錯(cuò)誤的結(jié)論。衛(wèi)生部于2003年9月頒布GB 15193.14-2003《致畸試驗(yàn)》［3］，但對(duì)數(shù)據(jù)處理的說(shuō)明較為含糊，難以切實(shí)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)者重視此問(wèn)題。甘卉芳等［2］探討了常規(guī)致畸試驗(yàn)及其結(jié)果判定的規(guī)范化問(wèn)題，但并未提出如何進(jìn)行規(guī)范的統(tǒng)計(jì)分析。王炳順等［4］采用了廣義估計(jì)方程處理致畸試驗(yàn)窩效應(yīng)并采用SUDAAN軟件實(shí)現(xiàn)其分析過(guò)程，但多數(shù)醫(yī)學(xué)研究者并不了解SUDAAN軟件，導(dǎo)致其推廣受限。以“致畸試驗(yàn)”作為主題詞，檢索關(guān)于“致畸試驗(yàn)”的期刊論文，發(fā)現(xiàn)其中大部分的研究者或?qū)ζ浣y(tǒng)計(jì)分析方法含糊其辭，或采用“常規(guī)統(tǒng)計(jì)分析方法（方差分析或χ2檢驗(yàn)）”來(lái)處理致畸試驗(yàn)中的“非常規(guī)數(shù)據(jù)”（存在窩別效應(yīng)）。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的誤用勢(shì)必導(dǎo)致結(jié)果的可靠性降低。

目前可處理此類具有聚集性數(shù)據(jù)的方法有廣義估計(jì)方程（generalized estimation equations，GEE）、多水平模型（multi-level model）、混合效應(yīng)模型（mixed effectsmodel）等，可采用多種軟件完成統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程，如SAS、R、MLw in、Stata等，不同的軟件在擬合模型時(shí)所用的模型估計(jì)方法和計(jì)算機(jī)算法有所差別，使得模型結(jié)果略有不同。本文探討采用多水平模型對(duì)致畸試驗(yàn)仔體數(shù)據(jù)中窩別效應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，并介紹應(yīng)用廣泛且易于操作的SPSS 20.0軟件的實(shí)現(xiàn)過(guò)程，以期為正確處理致畸試驗(yàn)數(shù)據(jù)提供參考。

問(wèn)題背景

1.觀察指標(biāo)

致畸試驗(yàn)中，常用孕鼠作試驗(yàn)對(duì)象，將其隨機(jī)分為兩組或多組，分別給予可疑致畸物及對(duì)照處理，待分娩后，觀察每個(gè)孕鼠及所產(chǎn)子代中發(fā)生畸形的情況。主要的觀察指標(biāo)包括兩部分，一是對(duì)母體的觀察：體重變化、中毒癥狀、黃體數(shù)、著床數(shù)（率）、吸收胎數(shù)（率）、早死胎數(shù)（率）、晚死胎數(shù)（率）和活胎數(shù)（率）、胎盤重量等；二是對(duì)仔體的觀察：性別、體重、身長(zhǎng)、外觀畸形、內(nèi)臟畸形、骨骼畸形和發(fā)育（骨化）情況等。

對(duì)于母體的觀察指標(biāo)，由于各孕鼠間獨(dú)立，故采用常規(guī)的統(tǒng)計(jì)分析方法即可。而對(duì)于仔體的觀察指標(biāo)，由于窩別效應(yīng)的存在，同一窩別的仔鼠的體重、發(fā)生畸形的概率趨于相同，而不同窩別仔鼠的體重、發(fā)生畸形的概率則趨于不同。這類資料的特點(diǎn)是存在層次結(jié)構(gòu)，即孕鼠-仔鼠。傳統(tǒng)的方差分析或χ2檢驗(yàn)忽略了數(shù)據(jù)層次結(jié)構(gòu)的特征，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。多水平模型是處理這種具有聚集性資料的簡(jiǎn)單且有效的統(tǒng)計(jì)分析方法［5］。胎仔體重是仔鼠發(fā)育的一個(gè)重要指標(biāo)，而“是否畸形”是判斷受試物致畸性的主要指標(biāo)。本文以上述兩個(gè)指標(biāo)為例，分別介紹兩水平模型、兩水平logistic模型處理致畸試驗(yàn)中具有窩別效應(yīng)的定量資料及定性資料。

2.兩水平模型原理

多水平模型是英國(guó)教育統(tǒng)計(jì)學(xué)家H.Goldstein于1986年提出，專門用于處理多層次或多水平結(jié)構(gòu)的資料［6］。致畸試驗(yàn)的數(shù)據(jù)具有明顯的層次結(jié)構(gòu)，母鼠為2水平單位（level-2 unit），仔鼠為1水平單位（level-1 unit）。

（1）定量資料的兩水平模型

考慮一個(gè)簡(jiǎn)單的2水平模型，結(jié)局變量為連續(xù)型隨機(jī)變量，且服從正態(tài)分布，只包含一個(gè)解釋變量，則

故上述2水平模型又可表示為yij＝β0＋β1x＋（u0j＋u1j＋εij），該模型由兩部分組成：固定部分和隨機(jī)部分。致畸試驗(yàn)中解釋變量為組別（group），不考慮解釋變量的隨機(jī)效應(yīng)，故模型變?yōu)?/p>

（2）二分類定性資料的兩水平logistic模型

實(shí)際工作中結(jié)局變量為定性變量的情況不在少數(shù)，如是否發(fā)病、藥物是否有效、仔鼠是否有畸形等，此時(shí)，一般的線性模型不再適用。廣義線性模型（generalized linearmodel，GLM）被廣泛應(yīng)用于定性結(jié)局變量的數(shù)據(jù)處理，通過(guò)非線性函數(shù)（non-linear link function）將反應(yīng)變量與線性預(yù)測(cè)指標(biāo)聯(lián)系起來(lái)。對(duì)于logistic回歸模型，選擇的連接函數(shù)為logit函數(shù)，即對(duì)結(jié)局變量進(jìn)行l(wèi)ogit變換，含有一個(gè)解釋變量的logistic回歸模型可表示如下形式：

多水平模型也可以推廣到非正態(tài)情形。致畸試驗(yàn)中模型為

實(shí)例分析及SPSS實(shí)現(xiàn)

下面結(jié)合實(shí)例來(lái)說(shuō)明如何通過(guò)專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS實(shí)現(xiàn)分析過(guò)程。在研究某化學(xué)物質(zhì)的致畸試驗(yàn)中，將26只孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組在孕早期每天給予一定劑量的受試物，對(duì)照組給予等量的蒸餾水。待孕鼠分娩后，測(cè)量仔鼠體重并且觀察仔鼠某種畸形的發(fā)生數(shù)。

現(xiàn)在要比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔鼠的發(fā)育情況（體重作為測(cè)量指標(biāo)）以及兩組的仔鼠畸形發(fā)生率。如果忽略窩別效應(yīng)，直接進(jìn)行兩組的比較，如文獻(xiàn)中常采用的t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組仔鼠與對(duì)照組相比，體重和畸形發(fā)生率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組體重較低，畸形發(fā)生率較高。提示受試物可影響胎鼠的生長(zhǎng)發(fā)育，亦可提高胎鼠的畸形發(fā)生率。

表1 忽略窩別效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

《致畸試驗(yàn)（GB 15193.14-2003）》中指出“胎鼠身長(zhǎng)、體重、窩平均活胎數(shù)、子宮連胎重量用t檢驗(yàn)，胎鼠的數(shù)據(jù)以窩為單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)?！边@種方法可稱之為“窩平均法”，將每個(gè)孕鼠作為試驗(yàn)單位，各指標(biāo)以每窩均數(shù)為基礎(chǔ)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。如對(duì)于仔鼠體重，可先計(jì)算每窩胎鼠的平均體重，再進(jìn)行t檢驗(yàn)；對(duì)于畸形發(fā)生率，將每窩比率作平方根反正弦變換后作t檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示與忽略窩別效應(yīng)時(shí)的結(jié)論相反，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的體重和畸形發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 “窩平均法”的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

考慮致畸試驗(yàn)中仔鼠數(shù)據(jù)的層次特征，即窩別效應(yīng)，現(xiàn)采用兩水平模型進(jìn)行分析。檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。SPSS操作過(guò)程見(jiàn)表4。對(duì)于體重來(lái)講，水平2單位（不同孕鼠間）的隨機(jī)效應(yīng)殘差（即窩別效應(yīng)）方差為0.1656，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.0559，Wald檢驗(yàn)結(jié)果χ2＝8.961，P＜0.001，認(rèn)為不同窩別的仔鼠體重總體均數(shù)是不同的，即存在“窩別效應(yīng)”。同樣，對(duì)于畸形發(fā)生率來(lái)講，水平2單位（不同孕鼠間）的隨機(jī)效應(yīng)殘差（即窩別效應(yīng)）Z檢驗(yàn)結(jié)果Z＝2.212，P＝0.027＜0.05，亦存在“窩別效應(yīng)”。故采用兩水平模型是合適的。在考慮了“窩別效應(yīng)”后，體重及畸形發(fā)生率在不同組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，尚不能認(rèn)為該受試物會(huì)影響仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育或?qū)е伦惺蠡伟l(fā)生增加。

表3 兩水平模型的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

表4 SPSS軟件處理傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)中仔體資料的操作過(guò)程

討 論

1.由以上結(jié)果可以看出，將每個(gè)仔鼠作為試驗(yàn)單位，忽略窩別效應(yīng)，簡(jiǎn)單采用傳統(tǒng)的分析方法t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)是不對(duì)的，最終會(huì)導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)推斷結(jié)論的偏倚。由于同一孕鼠所產(chǎn)m個(gè)胎仔之間不獨(dú)立，其提供的信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于m個(gè)來(lái)自不同孕鼠所產(chǎn)胎仔的觀測(cè)值所提供的信息。窩別效應(yīng)存在時(shí)，均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤是要比獨(dú)立數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤大，因此，當(dāng)用傳統(tǒng)方法計(jì)算時(shí)，會(huì)增加犯假陽(yáng)性的概率。如本文實(shí)例中所呈現(xiàn)的情形。

2.窩平均法是將孕鼠作為分析的基本單元，將個(gè)體水平的信息整合到群體水平，這樣的做法會(huì)低估個(gè)體水平的變異，損失了大量樣本數(shù)據(jù)的信息。而且由于孕鼠水平的觀察單位數(shù)通常較少，樣本含量較小，檢驗(yàn)效能降低，導(dǎo)致參數(shù)估計(jì)和統(tǒng)計(jì)推斷的不可靠，增加犯假陰性的概率。因此，窩平均法在致畸試驗(yàn)中的應(yīng)用也不合適。

3.多水平模型是專門用于處理具有多層次或多水平結(jié)構(gòu)資料的分析方法，針對(duì)定量資料和定性資料均有相應(yīng)的模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。目前，已有多種統(tǒng)計(jì)分析軟件可實(shí)現(xiàn)多水平模型的分析，如MLw iN是用于多水平分析的專用軟件，SAS的M IXED、Glimmix、Nlmixed過(guò)程亦可擬合多水平結(jié)構(gòu)的線性或廣義線性模型，Stata統(tǒng)計(jì)軟件亦有相應(yīng)指令。但在實(shí)際工作中，研究者或?qū)Χ嗨侥Ｐ筒涣私?，或?qū)y(tǒng)計(jì)軟件不熟悉，或?qū)?fù)雜的編程望而生畏，從而制約了聚集性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法的實(shí)際應(yīng)用。本文中介紹的SPSS軟件操作相對(duì)簡(jiǎn)單，結(jié)果讀取清晰明了，對(duì)多數(shù)醫(yī)學(xué)研究者來(lái)說(shuō)易于掌握。

1.王心如，周宗燦.毒理學(xué)基礎(chǔ).人民衛(wèi)生出版社，2007.

2.甘卉芳，李百祥，剛葆琪.常規(guī)致畸試驗(yàn)及其結(jié)果判定的規(guī)范化問(wèn)題.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002（2）：59-61.

3.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 15193.14-2003致畸試驗(yàn).2003.

4.王炳順，宮麗崑，高爾生等.常規(guī)致畸試驗(yàn)窩效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)處理及統(tǒng)計(jì)軟件實(shí)現(xiàn).中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)，2003（4）：10-13.

5.楊珉，李曉松.醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生研究常用多水平統(tǒng)計(jì)模型.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007.

6.饒克勤.衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)方法與應(yīng)用進(jìn)展.第2卷.人民衛(wèi)生出版社，2008.

（責(zé)任編輯：郭海強(qiáng)）

1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（510080）

2.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（528248）

△通信作者：張晉昕，E-mail：zhjinx＠m(xù)ail.sysu.edu.cn