萬強琨，汪庚明(綜述)，江 浩(審校)

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科,安徽 蚌埠 233000)

目前，惡性腫瘤已成為威脅人類健康的頭號殺手，其治療失敗的主要原因是浸潤與轉移。腫瘤轉移抑制基因逐漸成為近年來的研究熱點。自1988年Steeg等[1]首先從小鼠黑色素瘤中分離出nm23基因起，數(shù)十種腫瘤轉移抑制基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，而其調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、分化、死亡，抑制腫瘤細胞趨化與侵襲，限制腫瘤細胞遷徙的機制也逐漸被揭開。絲裂原活化蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4)基因為新發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉移抑制基因，現(xiàn)將在國內(nèi)外最新研究成果的基礎上，對MKK4基因進行綜述。

1 MKK4的概述

Yoshida等[2]利用微細胞染色體轉移和定點克隆方法分離出的MKK4基因位于人類第17號染色體，基因全長>1200 bp，含11個外顯子和1個啟動子，編碼1條含有399個氨基酸的蛋白質。MKK4蛋白結構由3個部分組成：位于N端的D域序列在級聯(lián)反應中與c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38(p38 mitogen-activated protein kinase)連接；位于C端的DVD域序列與上游的各種MKKKs級聯(lián)；中間部分為激酶區(qū)，包括11個亞基，其中，7、8亞基間S-I-A-K-T序列的蘇氨酸與絲氨酸殘基磷酸化后可激活MKK4基因[3]。MKK4 mRNA廣泛地表達于人體組織，以大腦皮質、小腦、丘腦、海馬體的表達最高。亞細胞定位研究顯示MKK4蛋白主要表達于細胞質內(nèi)，一些細胞核中也有少量表達。

2 MKK4的作用機制

首先，絲裂原激活蛋白激酶4的激酶(MKKK4)通過磷酸化絲氨酸/蘇氨酸殘基來激活MKK4，不同的MKKKs激活不同的MKKs，具有專一性。通過激活狀態(tài)的MKK4，可激活絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路和(或)磷酸化下游信號，最終調(diào)控轉錄因子的活化，介導細胞的生長、分化、凋亡等生物學行為[4]。目前認為，MAPK信號通路包括：mitogen-activated protein(MAP)激酶、MAPK和有絲分裂原活化抑制劑(MEK)激酶。而目前在哺乳動物中確認的4條相互并行的MAPK通路分別是胞外信號調(diào)節(jié)激酶、JNK、p38和胞外信號調(diào)節(jié)激酶5。MKK4是一種有雙重特異性的激酶，也被稱為JNKK1，SEK2或MEK4，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。MKK4可激活JNK的所有亞型(JNK1、JNK2、JNK3)和部分p38亞型(p38a、p38b)，將細胞外刺激信號轉導至細胞及細胞核內(nèi)，引起細胞的增殖、分化、轉化及凋亡等生物學反應。多數(shù)情況下，JNK通路和p38通路表現(xiàn)為協(xié)同作用，凋亡信號可以同時激活這兩條通路[5]。

2.1MKK4-JNK的作用機制 JNK通路在細胞接受環(huán)境應激信號后被MKK4激活。JNK活化后轉移到細胞核，活化轉錄因子并結合到基因啟動子上，提高轉錄活性，促進基因的表達和蛋白質的合成。對于JNK通路，目前存在一種協(xié)同作用假說，即MKK4與MKK7協(xié)同作用激活JNK通路。一些有關小鼠胚胎干細胞及成纖維細胞的實驗可以論證這個假說。MKK4通過依次磷酸化酪氨酸、絲氨酸殘基來激活JNK。Das等[6]發(fā)現(xiàn)，MKK4/MKK7磷酸化后，利用JNK通路激活核因子κB、轉錄因子AP-1(activator protein-1)?；罨腁P-1調(diào)節(jié)下游的靶基因的表達，同時參與細胞基質的降解、新生血管形成等過程。過去的研究普遍認為，JNK通路與細胞凋亡的調(diào)節(jié)密切相關，JNK在線粒體中通過信號調(diào)控B淋巴細胞/白血病2(Bcl-2)家族成員參與細胞凋亡過程[7]。目前被認可的途徑主要有兩條：JNK在線粒體水平上激活內(nèi)源性細胞凋亡途徑的促凋亡蛋白并且誘導細胞色素C釋放，最后啟動級聯(lián)反應引起細胞凋亡；JNK對外源性細胞周期凋亡途徑起促進作用，而JNK的濃度和持久度決定了細胞在接受外源性信號刺激時是否凋亡[8]。Finegan等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MKK4與Ras基因突變有關，且腫瘤形成能力的下降與MKK4通過JNK信號通路調(diào)節(jié)上皮生長因子受體的表達有關。

2.2MKK4-p38的作用機制 p38能抑制細胞周期進程，阻止細胞進入有絲分裂期[10]。在MKK4的紫外線激活實驗中，不但論證了MKK4可以激活p38，同時觀測到可以通過調(diào)節(jié)MKK4的水平來調(diào)節(jié)p38活化反應的強弱。MKK4通過同時磷酸化酪氨酸、蘇氨酸殘基激活p38，然后通過兩條途徑遏制細胞周期進程：直接磷酸化cdc25B分子，使細胞周期蛋白/cd2不能被激活，處于抑制狀態(tài)，紫外線與烷化劑類化療藥物可介導這一途徑；通過調(diào)控細胞周期基因的表達。

2.3MKK4基因啟動子區(qū)多態(tài)性對癌癥的影響 基因的啟動子決定了其轉錄活性，啟動子的遺傳變異可能影響其功能。Wei等[11]在一項直腸癌研究中同樣提出，MKK4基因啟動子區(qū)域內(nèi)具有潛在功能的遺傳變異位-1304T→G(rs3826392，相對翻譯起始位點為-1304nt)的變異情況可能與患癌風險有關。TG+GG攜帶者患病率更低。當-1304T→G的多態(tài)位點為T等位基因時，MKK4基因啟動子中存在轉錄因子NKx-2結合位點，而基因突變后(T轉變?yōu)镚)，該結合位點消失。Homminga等[12]研究指出，NKx-2結合位點具有致癌作用。另有學者推測，該位點的變異，能增加它與Tnx-2等轉錄因子的契合程度，增強MKK4基因的轉錄活性，從而使MKK4表達量增加[13]。單核苷酸多態(tài)性在基因組中具有高密度和遺傳穩(wěn)定性的特點，是個體間遺傳差異的主要來源，也是腫瘤等多種基因疾病的發(fā)病基礎。MKK4的4個主要的單核苷酸多態(tài)性位點分別為：RS3809728、RS2190853、RS9892151、RS3826392[14]。

作為MAPK信號轉導通路的主要組成部分，癌基因Res信號轉導通路的中心環(huán)節(jié)，MKK4基因的多態(tài)性可能對MKK4的轉錄啟動效應產(chǎn)生影響并與某些癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預后有著密切的聯(lián)系。

3 MKK4的抑癌作用

MKK4對腫瘤轉移抑制的調(diào)控可能通過降低腫瘤細胞的黏附作用，并促進其凋亡，抑制其增殖。一些研究結果顯示，MKK4基因的改變廣泛存在于胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、睪丸癌、肺癌等惡性腫瘤中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系[15]。基因改變主要包括基因突變以及純合子的缺失，這導致MKK4蛋白的關鍵亞基無法合成特定的氨基酸致使其無法對JNK磷酸化，發(fā)生概率為3%～5%。而MKK4基因顯性無意義的突變能促使胚胎干細胞變異，并提高其致癌危險性。MKK4被認為是抑癌基因的另一個理由是其緊鄰p53基因，僅相距10 cM(分摩)[16]。

3.1基因啟動子區(qū)多態(tài)性對肺癌的抑制作用 一些研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞株中存在MKK4基因編碼區(qū)的純合性缺失。肺癌的發(fā)生與發(fā)展是一個多因素、多階段的過程，其中的眾多因素都可以使包括MKK4在內(nèi)的多種MAPKs信號通路中的分子的結構功能發(fā)生改變，由于一些研究結果顯示，肺癌組織中MKK4基因表達低下，有些學者推測，MKK4基因啟動子區(qū)域的改變可能對肺癌的發(fā)生有著重要影響。黃斌芳等[17]采用TaqMan探針技術檢測MKK4基因啟動子區(qū)多態(tài)位點rs3826392(-1304T→G)的基因型并分析其與肺癌易患性的相關性，結果發(fā)現(xiàn)，與攜帶TT基因型個體相比，攜帶TG雜合子的個體患肺癌的風險下降25%，而攜帶GG變異純合子者患肺癌的風險下降45%，隨著變異型等位基因G的個數(shù)增加，肺癌發(fā)病風險逐步降低。

3.2MKK4基因啟動子區(qū)多態(tài)性對鼻咽癌的抑制作用 EB(Epstein-Barr)病毒的潛伏期蛋白是引起鼻咽癌發(fā)生的重要致癌蛋白[18]。EB病毒膜潛伏蛋白與MKK4一樣，可激活JNK通路，影響細胞的正常增殖與凋亡，從而導致癌癥的發(fā)生。Zheng等[19]在EB病毒-MKK4基因遺傳變異的交互作用與鼻咽癌危險性研究中，采用TAQMAN技術分析MKK4基因遺傳變異-1340T→G與鼻咽癌發(fā)生關聯(lián)，以及EB病毒感染狀態(tài)與MKK4基因遺傳變異的交互作用在鼻咽癌發(fā)生中的相關性，研究表明，隨著保護性等位基因G的個數(shù)增加，鼻咽癌發(fā)病風險逐步降低，EB病毒-MKK4基因交互作用，是華南人群鼻咽癌發(fā)病的危險性因素。

通過近年來關于MKK4基因 -1340T→G位點與癌癥發(fā)生相關性的研究結果，認為MKK4基因啟動子區(qū)多態(tài)性對多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展有著復雜而重要的作用。相關機制的研究目前未見報道。

3.3MKK4基因對卵巢癌的抑制作用 Yamada等[16]研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常卵巢上皮細胞，卵巢癌細胞的MKK4基因表達顯著降低。而MKK4基因呈高表達的卵巢癌其轉移能力顯著低于MKK4基因低表達者，且存活期延長70%。Yeamin等[20]研究同樣證明類似結論。另有研究表明，MKK4基因能抑制SKOV3細胞株轉移能力，使其難以形成轉移細胞集落。Tanoue等[21]將未轉染MKK4的人類卵巢癌細胞株SKOV3ip.1與轉染MKK4的該細胞株注射于免疫缺陷的小鼠腹中，發(fā)現(xiàn)轉染MKK4細胞株的網(wǎng)膜轉移率較未轉染者降低88%。

3.4MKK4基因對葡萄膜黑色素瘤的抑制作用 近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，不同侵襲力的葡萄膜黑色素瘤細胞間基因的表達存在較大的差異，MKK4基因的上游因子p21-activated kinase(PAK)與葡萄膜黑色素瘤細胞的侵襲性密切相關，在侵襲表型的腫瘤中，PAK1呈高表達，干擾PAK1表達后，腫瘤細胞的侵襲能力顯著降低[22]。這表明，MKK4基因上游信號可通過MKK4來改變MAPK通路中JNK與p38的信號傳遞，從而抑制黑色素瘤的侵襲。而MKK4基因在葡萄膜黑色素瘤細胞發(fā)展過程中所起到的具體作用及機制仍在研究中。

4 MKK4基因的致癌作用

盡管近年來的多項研究證實，MKK4基因具有抑癌基因的功能，但也有研究顯示，MKK4基因在人類腫瘤中的作用并非那么簡單[23]。MKK4基因的上游信號Res在目前人類腫瘤中普遍呈活化狀態(tài)。而MKK4基因下游信號JNK與p38以及轉錄因子AP-1則與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[21]。這些研究結果又在某種程度上說明了MKK4基因存在致癌作用。

4.1MKK4基因在胰腺癌細胞中的致癌作用 Cunningham等[24]在特異性靶向斷裂胰腺癌細胞株PL5的MKK4基因試驗中提出了MKK4基因的致癌作用。腺病毒載體可以高效地表達目的基因，這一觀點在體外實驗中同樣適用[25]。王磊等[26]構建MKK4基因的腺病毒載體，感染不表達MKK4的胰腺癌細胞株，同時運用蛋白免疫印跡雜交技術檢測常見胰腺痛細胞株中MKK4的表達，結果發(fā)現(xiàn)，轉移胰腺腺癌細胞、原位胰腺腺癌細胞感染MKK4腺病毒后，細胞增生能力及浸潤能力均顯著增強。這一結果與Cunningham等[22]的實驗結果不謀而合，同樣論證了MKK4基因在胰腺癌中的致癌作用。

4.2MKK4基因在前列腺癌中的致癌作用 前列腺癌是西方發(fā)達國家男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。Khamis等[27]通過了解過渡良性前列腺上皮內(nèi)瘤、局部癌和轉移癌的細胞的分子基礎研究工作，對公認牽連的轉移抑制基因在前列腺癌的作用進行了討論表明MKK4基因在過渡良性前列腺上皮內(nèi)瘤中表達較低，而在局部晚期浸潤及轉移癌中出現(xiàn)高表達。Szmulewitz等[28]檢測了人類前列腺癌和前列腺癌模型鼠的前列腺癌組織的MKK4基因和MKK7基因表達，得出類似結論，從而指出該結果可能由于相關基因轉錄增加和轉錄調(diào)控有關聯(lián)。

5 小 結

MKK4基因在激活JNK、p38通路，調(diào)節(jié)、影響細胞周期及細胞凋亡中發(fā)揮著重要且極其復雜的作用。對于MKK4基因作為腫瘤抑制基因，在什么樣的環(huán)境下，選擇什么樣的通路來抑制腫瘤的發(fā)生及轉移，又在什么樣的狀態(tài)下發(fā)揮癌基因的作用，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，人們所知甚少。目前有學者試圖建立不同的動物實驗模型，進一步研究MKK4基因的抑癌、致癌機制及作用條件。這對相關腫瘤的早期診斷、治療方案的制訂、藥物選擇以及個體靶向治療都有著積極的意義。

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