黃 娟，雍小蘭，馮仕銀，王藍(lán)天，杜曉琳，李 楠（成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，成都 610083）

鹽酸莫西沙星為第四代新型喹諾酮類超廣譜抗菌藥物，其抗菌譜覆蓋了全部呼吸道主要致病菌，主要用于慢性支氣管炎急性加劇者、社區(qū)獲得性肺炎以及急性細(xì)菌性鼻竇炎。莫西沙星具有良好的藥動(dòng)學(xué)特性，口服吸收良好，生物利用度高，具有良好的組織穿透力[1]，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。測定動(dòng)物和人血漿中的莫西沙星濃度的方法已有報(bào)道[2-8]，但本試驗(yàn)選擇氟康唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，性質(zhì)穩(wěn)定、提取回收率高；流動(dòng)相簡單，不含磷酸緩沖鹽；經(jīng)液-液萃取樣品干凈，回收率穩(wěn)定，具有一定的優(yōu)越性。該反相高效液相色譜（RP-HPLC）法具有操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、試劑便宜等優(yōu)點(diǎn)，適用于莫西沙星的臨床血藥濃度測定和藥動(dòng)學(xué)研究以及Ⅰ期臨床試驗(yàn)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB135-S十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Thermo ST16R型冷凍離心機(jī)（美國熱電公司，離心半徑：16 cm）；渦旋混合器（北京踏錦科技有限公司）；－80 ℃低溫冰箱（中國海爾公司）；Turbo Vap LV型濃縮儀（美國Caliper公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸莫西沙星對(duì)照品（德國拜耳公司，純度：96.2%，批號(hào)：R-1004-01G）；內(nèi)標(biāo)：氟康唑?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，純度：99.9%，批號(hào)：100314-200503）；甲醇、乙腈均為色譜純，二氯甲烷、乙醚為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（含0.05%三氟醋酸，22∶78）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：296 nm（0～2.5 min）、256 nm（2.5～4.5 min）、296 nm（4.5～8.0 min）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。在該試驗(yàn)條件下，莫西沙星與內(nèi)標(biāo)能完全分離，不受血漿內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，莫西沙星與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為6.2 min與3.4 min。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+2.0 μg/ml莫西沙星溶液+內(nèi)標(biāo)（200 μg/ml氟康唑?qū)φ掌罚┤芤?；C.給藥后2 h的血漿樣品；1.氟康唑；2.莫西沙星Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+2.0 μg/ml moxifloxacin+200 μg/ml internal standard；C.plasma sample 2 h after medication；1.fluconazole；2.moxifloxacin

2.2 溶液的配制

（1）對(duì)照品貯備液：準(zhǔn)確稱取鹽酸莫西沙星對(duì)照品5.46 mg（相當(dāng)于莫西沙星5.0 mg）于5 ml量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，得莫西沙星貯備液。（2）內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取氟康唑?qū)φ掌?0.31 mg于10 ml量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，得內(nèi)標(biāo)貯備液；取內(nèi)標(biāo)貯備液，用甲醇-水（1∶1）稀釋，配制成200 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃下保存，備用。（3）萃取劑：乙醚-二氯甲烷（3∶2）。

2.3 血漿樣品的處理

精密吸取血漿200 μl，加入10 μg/ml內(nèi)標(biāo)氟康唑溶液100 μl，混勻后加入萃取劑4 ml，渦旋混勻5 min。于3 200 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于尖底試管中，30 ℃水浴氮?dú)饬鞔蹈?。殘?jiān)眉状?水（1∶1）100 μl復(fù)溶，進(jìn)樣20 μl。

2.4 線性關(guān)系及定量下限考察

取空白血漿配制成含莫西沙星分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，其余按“2.3”項(xiàng)下方法處理，記錄色譜。以莫西沙星峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）與對(duì)應(yīng)濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝94.02x－0.005（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，莫西沙星血藥濃度在0.05～10 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.05 μg/ml。定量下限的精密度RSD和回收率分別為1.87%和108.79%（n＝5）。

2.5 精密度試驗(yàn)

配制莫西沙星為0.2、2.0、8.0 μg/ml的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣本，各6份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的方法的精密度與準(zhǔn)確度均達(dá)到試驗(yàn)要求。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝6）

2.6 回收率試驗(yàn)

配制莫西沙星為0.2、2.0、8.0 μg/ml的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣本，各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，測定所得莫西沙星峰面積與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣所得峰面積相比，計(jì)算提取回收率；根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測質(zhì)量濃度，以實(shí)測值與理論值相比計(jì)算方法回收率，結(jié)果見表1。其中，內(nèi)標(biāo)的提取回收率為97.31%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制莫西沙星為0.2、2.0、8.0 μg/ml的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣本，按“2.3”項(xiàng)下方法處理。分別考察了血漿樣本室溫放置8 h、反復(fù)凍融3次以及－80 ℃冷凍放置30 d的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在上述穩(wěn)定性考察條件下，莫西沙星的質(zhì)量濃度均保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯變化。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（，n＝3）Tab 2 Results of stability tests（，n＝3）

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（，n＝3）Tab 2 Results of stability tests（，n＝3）

2.8 樣品測定

結(jié)核性胸膜炎患者靜脈滴注鹽酸莫西沙星注射液400 mg，給藥后0.3、2、4 h時(shí)采集前臂靜脈血3 ml，分離血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測定，結(jié)果分別為3.16、2.27、1.97 μg/ml。

3 討論

目前血漿中莫西沙星濃度的測定方法主要有高效液相色譜熒光檢測法[3]、高效液相色譜紫外檢測法[4-7]和液-質(zhì)聯(lián)用法[8]。與紫外檢測相比，熒光檢測法的應(yīng)用范圍較窄，對(duì)干擾非常敏感；液質(zhì)聯(lián)用法則成本高。故本試驗(yàn)采用了RP-HPLC法，選擇氟康唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)。因?yàn)榉颠虻奈詹ㄩL為256 nm，莫西沙星的吸收波長為296 nm，所以采用了分段改變波長的方法進(jìn)行檢測，二者的分離度符合要求，切換波長不影響檢測。與文獻(xiàn)[2-6]相比，本試驗(yàn)的流動(dòng)相簡單，不含磷酸緩沖鹽，莫西沙星出峰時(shí)間短，具有一定的優(yōu)越性。

本試驗(yàn)選用乙醚-二氯甲烷作萃取劑，不用調(diào)酸堿度。與文獻(xiàn)[4-5]中使用的樣本量相比，本試驗(yàn)所用血漿量更少，從0.5、1 ml減少到0.2 ml。文獻(xiàn)[5]中，健康志愿者單劑量口服400 mg莫西沙星后，血漿峰值濃度為（3.06±0.42）μg/ml，本試驗(yàn)的定量下限為0.05 μg/ml，能滿足峰值濃度的1/20的要求，可應(yīng)用于其藥動(dòng)學(xué)和生物等效性研究。

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