金偉華，陳 華，張 明，蒲志強(qiáng)，鐘 妙（.成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，成都 60083；.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，四川瀘州 646000）

甘露聚糖肽是從健康人口腔分離的α-溶血性鏈球菌菌株經(jīng)深層培養(yǎng)、發(fā)酵提取而得到的一種具有免疫活性和抗腫瘤作用的糖肽類(lèi)物質(zhì)，其具有明顯增強(qiáng)人體免疫功能及抗腫瘤的作用。臨床上用于免疫功能低下、反復(fù)呼吸道感染、白細(xì)胞減少、再生障礙性貧血及腫瘤的輔助治療。目前，甘露聚糖肽已開(kāi)發(fā)的劑型有片劑、口服液、膠囊劑、注射液，但尚無(wú)對(duì)甘露聚糖肽滴鼻液的研究。為此，我們研制了甘露聚糖肽滴鼻液。該制劑用于改善免疫功能低下以及免疫功能低下所致的反復(fù)呼吸道感染、肝炎、肝硬化的抗病毒治療等。將甘露聚糖肽制成滴鼻液可避免肝臟首關(guān)效應(yīng)，提高藥物的生物利用度。甘露聚糖肽是具有免疫活性的糖肽類(lèi)物質(zhì)，目前關(guān)于復(fù)雜體系中單糖檢測(cè)尚缺少普適的高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)方法，專(zhuān)用糖柱（配體交換分離）價(jià)格昂貴、易損耗且樣品前處理繁瑣[1]。多數(shù)制藥企業(yè)及藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)主要采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)控制甘露聚糖肽制劑的質(zhì)量。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）是一種具有強(qiáng)紫外吸收的衍生試劑，該試劑可以與還原性糖在溫和條件下反應(yīng)，產(chǎn)物無(wú)立體異構(gòu)體且在紫外245 nm 波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的吸收。因此，本研究將甘露聚糖肽水解為甘露糖，采用PMP對(duì)甘露糖進(jìn)行柱前衍生，建立了甘露聚糖肽滴鼻液中甘露糖的柱前衍生化HPLC法，得到了令人滿(mǎn)意的結(jié)果。

1 材料

1.1 儀器

1200 型HPLC 儀（美國(guó)安捷倫公司）；AL204 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，精度：0.000 1 g]；HH-S24S 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海君竺儀器制造有限公司）；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甘露聚糖肽原料藥（成都利爾藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130301，藥用級(jí)）；d-甘露糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140651-200602，供含量測(cè)定用）；PMP（成都市科龍化工試劑廠(chǎng)，批號(hào)：20120801，純度：≥99.0%）；氯化鈉（江蘇省勤奮藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20130129，藥用級(jí)）；滅菌注射用水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：A130402L）；水為三重蒸餾水。

2 處方與制備

2.1 處方

甘露聚糖肽10.0 g，氯化鈉6.0 g，加注射用水至1 000 ml。

2.2 制備

稱(chēng)取處方量甘露聚糖肽、氯化鈉，加注射用水適量攪拌溶解后，再加注射用水至全量，攪拌均勻，加入0.1%注射用活性炭，加熱煮沸15 min，趁熱脫炭，無(wú)菌過(guò)濾，測(cè)定含量、pH等；合格后灌封于5 ml滴鼻液瓶中，進(jìn)行澄明度、外觀色澤、含量、有關(guān)物質(zhì)等檢查，即得甘露聚糖肽滴鼻液，設(shè)立批號(hào)為：20130415、20130419、20130422。

3 質(zhì)量控制

3.1 性狀

本品應(yīng)為淡黃色澄明液體。

3.2 pH

量取本品50 ml，依據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄ⅥH項(xiàng)下pH測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定[2]，本品pH應(yīng)為5.5～7.0。

3.3 其他

其他各項(xiàng)（鑒別、裝量、微生物限度）檢查均應(yīng)符合2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄ⅠR項(xiàng)下鼻用制劑要求[2]。

3.4 含量測(cè)定

3.4.1 色譜條件。色譜柱：Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液（20∶80），流速：1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μl。

3.4.2 甘露糖對(duì)照品貯備液的制備。精密稱(chēng)取d-甘露糖對(duì)照品0.010 7 g，置于100 ml量瓶中，加水適量使溶解，用水定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為107 μg/ml的對(duì)照品貯備液。

3.4.3 對(duì)照品溶液的制備。精密量取d-甘露糖對(duì)照品貯備液20、15、10、5 ml，分別置于25 ml量瓶中，用水定容至刻度，制備成質(zhì)量濃度分別為85.6、64.2、42.8、21.4 μg/ml的對(duì)照品溶液。

3.4.4 供試品溶液的制備。精密量取甘露聚糖肽滴鼻液2 ml，置于100 ml量瓶中，用水定容至刻度，搖勻；精密量取稀釋液2 ml，置于頂空瓶中，加入3.0 mol/L的鹽酸溶液2 ml，抽真空，封口，混勻，110 ℃水解2 h，冷卻后，用3.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，即得。

3.4.5 空白溶液的制備。精密量取2 ml水，置于頂空瓶中，按“3.4.4”項(xiàng)下方法操作制備成不含甘露聚糖肽的空白溶液。

3.4.6 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液各0.8 ml，分別加0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液與0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液[3]各0.8 ml，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min。冷卻后加0.3 mol/L 的鹽酸溶液0.9 ml，用三氯甲烷洗滌3 次，每次2 ml，棄去三氯甲烷液，水層過(guò)濾后，定容至3 ml。分別精密吸取上清液各10μl，照“3.4.1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀，記錄色譜。結(jié)果表明，空白溶液對(duì)甘露糖的測(cè)定無(wú)干擾，待測(cè)峰分離度良好，理論板數(shù)按甘露糖峰計(jì)算不低于5 000，分離度大于1.5。HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

3.4.7 線(xiàn)性關(guān)系考察。取“3.4.2”“3.4.3”項(xiàng)下107、85.6、64.2、42.8、21.4 μg/ml 的對(duì)照品溶液，按“3.4.6”項(xiàng)下方法衍生處理后，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為y＝157 25x－12.440（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，甘露糖檢測(cè)質(zhì)量濃度的線(xiàn)性范圍為21.4～107 μg/ml。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.空白溶液；1.PMP；2.甘露糖衍生物Fig 1 HPLC chromatogramsA.control solution；B.test sample solution；C.blank solution；1.PMP；2.mannose derivative

3.4.8 精密度試驗(yàn)。取質(zhì)量濃度為107 μg/ml 的對(duì)照品溶液，按“3.4.6”項(xiàng)下方法衍生處理后，進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜，計(jì)算峰面積的RSD＝1.87%（n＝6），表明此方法的精密度符合要求。

3.4.9 重復(fù)性試驗(yàn)。分別量取同一批樣品6 份，按“3.4.4”“3.4.6”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液后衍生處理，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，計(jì)算峰面積的RSD＝1.31%（n＝6），表明此方法的重復(fù)性良好。

3.4.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取樣品1 份，按“3.4.4”“3.4.6”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液后衍生處理，分別于0、1、2、4、6、24 h 內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，計(jì)算峰面積的RSD＝1.03%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.11 回收率試驗(yàn)。取已知含量的樣品，精密加入甘露糖對(duì)照品溶液適量（42.8、64.2、85.6 μg/ml），制備成低、中、高3種質(zhì)量濃度的溶液，按“3.4.4”“3.4.6”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液后衍生處理，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（n＝3）

3.4.12 樣品測(cè)定。取樣品3 批，按“3.4.4”“3.4.6”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液后衍生處理，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算含量，本品含甘露聚糖肽以甘露糖計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

4.1 甘露聚糖肽的水解

由于甘露聚糖肽完全由不同鏈長(zhǎng)的甘露聚糖肽分子構(gòu)成，不存在單糖、雙糖等小分子糖類(lèi)，因此首先應(yīng)水解甘露聚糖肽得到甘露糖。多糖的水解常采用鹽酸、硫酸、三氟乙酸。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，并權(quán)衡各種溶劑的優(yōu)缺點(diǎn)，本研究最終采用3.0 mol/L的鹽酸溶液作為水解溶媒。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

4.2 甘露糖的衍生化[4]

由于甘露糖沒(méi)有紫外吸收基團(tuán)，不能用于紫外檢測(cè)，因此本文采用PMP化學(xué)衍生法使甘露糖帶上紫外吸收基團(tuán)。PMP作為衍生化試劑，可以在溫和的水浴條件下與糖鏈進(jìn)行定量反應(yīng)；且HPLC法檢測(cè)甘露糖衍生物，靈敏度較高，重現(xiàn)性好。

4.3 pH的控制

本文的主要思路是“酸水解、堿衍生”。甘露聚糖肽在酸性條件下（pH應(yīng)控制在2～5）水解，水解后應(yīng)調(diào)節(jié)pH至中性；甘露糖衍生時(shí)，應(yīng)保證是在堿性條件下（pH 應(yīng)控制在9～12）進(jìn)行的。如果pH控制不好，試驗(yàn)很容易導(dǎo)致色譜圖中甘露糖衍生物無(wú)檢測(cè)信號(hào)。

4.4 PMP的萃取

甘露糖衍生反應(yīng)結(jié)束后，在油/水兩相分離時(shí)，應(yīng)充分混合溶劑，由于甘露糖衍生物太少，為了檢測(cè)甘露糖衍生物必須使三氯甲烷萃取過(guò)量的PMP。目前實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，利用三氯甲烷萃取PMP 已得到較好效果，雖仍然殘留部分PMP，但PMP剩余峰并不干擾目標(biāo)峰的測(cè)定。

[1]王立東，張麗萍.利用木聚糖酶酶解小麥麩皮制備低聚木糖工藝參數(shù)的研究[J].黑龍江八一龍墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，24（1）：61.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄17、18、44.

[3]章樂(lè)建，泮玉華，趙穎飛.高效液相色譜法測(cè)定樂(lè)清栽培的鐵皮石斛不同年份甘露糖的含量[J].海峽藥學(xué)，2012，24（3）：79.

[4]郝桂堂，陳尚衛(wèi)，朱松，等.對(duì)氨基苯甲酸衍生化高效液相色譜法分析多糖中的單糖及糖醛酸組成[J].色譜，2007，25（1）：75.