馬亞中，吳 燕，郭雙艷（空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142）

單硝酸異山梨酯是硝酸異山梨酯的主要活性代謝物[1]，其可通過(guò)擴(kuò)張外周血管、減少心肌耗氧量從而緩解或消除心絞痛[2]，臨床用于冠心病的長(zhǎng)期治療、血管痙攣型和混合型心絞痛的預(yù)防[3-4]。目前，國(guó)內(nèi)雖有很多廠家生產(chǎn)單硝酸異山梨酯緩釋膠囊，但質(zhì)量差別較大，緩釋效果較不理想，取樣時(shí)間點(diǎn)分別有不同程度的突釋現(xiàn)象，容易產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此，筆者研制了單硝酸異山梨酯緩釋膠囊。為了考察該制劑的生產(chǎn)工藝，保證不同批號(hào)產(chǎn)品之間的質(zhì)量穩(wěn)定性，筆者建立了考察該制劑體外釋放度的方法[5-7]。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀，包括四元泵、VWD檢測(cè)器（美國(guó)Aglient公司）；ZRS-8G溶出試驗(yàn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

單硝酸異山梨酯標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100694-200401，純度：99.9%）；單硝酸異山梨酯緩釋膠囊（自制品，批號(hào)：20121003、20121004、20 121005；對(duì)照品，珠海許瓦茲制藥有限公司，批號(hào)：611001；規(guī)格：均為每粒60 mg）；甲醇為色譜純；水為自制；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（37 ∶63），流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：25 ℃。溶劑：混合流動(dòng)相。理論板數(shù)按單硝酸異山梨酯峰計(jì)不低于5 000。取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、空白溶劑（即流動(dòng)相）及空白輔料溶液進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

精密稱取減壓干燥后的單硝酸異山梨酯標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度為100μg/ml的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取樣品細(xì)粉適量（約含主藥50 mg），至50 ml 量瓶中，加水適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 ml置于10 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，作為供試品溶液。按處方量稱取本品輔料，按供試品溶液制備方法制備成空白輔料溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取經(jīng)減壓干燥后的單硝酸山梨酯標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，置于50 ml 量瓶中，加水超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成1 mg/ml溶液；分別精密量取該溶液1、2、3、4、5、6、7 ml，分別置于50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成相當(dāng)于檢測(cè)質(zhì)量濃度20%、40%、60%、80%、100%、120%、140%的溶液，配成20～140 μg/ml 的線性質(zhì)量濃度，注入色譜儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為：A＝9.258 5c+9.077 8（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，單硝酸異山梨酯檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為20～140μg/ml。

圖1 高效液相色譜圖A.空白溶劑；B.空白輔料溶液；C.標(biāo)準(zhǔn)品溶液；D.供試品溶液（批號(hào)：20121003）；1.單硝酸異山梨酯Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.blank excipients solution；C.standard solution；D.test solution（lot No.20121003）；1.isosorbide mononitrate

2.4 回收率試驗(yàn)

按處方量稱取輔料，分別加入單硝酸異山梨酯標(biāo)準(zhǔn)品，相當(dāng)于處方量的80%、100%、120%，混合均勻，置于50 ml量瓶中，加水適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾；分別精密量取續(xù)濾液1 ml至10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密稱取單硝酸異山梨酯標(biāo)準(zhǔn)品約50 mg 置于50 ml量瓶中，用水適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)；精密量取1 ml至10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。依法測(cè)定含量并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果單硝酸異山梨酯峰面積的RSD＝0.47%（n＝6）。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液在室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣20 μl，測(cè)定。結(jié)果單硝酸異山梨酯峰面積的RSD＝0.75%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 釋放度測(cè)定

3.1 釋放介質(zhì)的選擇

考慮患者年齡、體質(zhì)、身體狀況等的不同，本試驗(yàn)采用2010年版《中國(guó)藥典》方法[8]及“日本藥品品質(zhì)再評(píng)價(jià)工程”中推薦使用的4種溶劑（水、pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液）為釋放介質(zhì)（其在后3種介質(zhì)中的線性方程分別為A＝9.617 5c+4.514 3、A＝9.842 3c－13.329 0、A＝10.021c－24.634，r分別為0.999 9、0.999 5、0.999 9）。分別于1、4、8 h取樣（批號(hào)：20121003）10 ml，過(guò)濾，同時(shí)補(bǔ)充等溫同體積的釋放介質(zhì)；取續(xù)濾液20 μl，測(cè)定，計(jì)算累積釋放度（%），結(jié)果見圖2。

圖2 單硝酸異山梨酯緩釋膠囊在4 種介質(zhì)中的累積釋放度比較Fig 2 Comparison of accumulative release rate of Isosorbide mononitrate sustained-release capsules in 4 mediums

由圖2可知，單硝酸異山梨酯緩釋膠囊在4種釋放介質(zhì)中的釋放行為沒有明顯差異。以簡(jiǎn)單方便為原則，選擇水為釋放介質(zhì)。

3.2 釋放度測(cè)定方法的選擇

本品為膠囊，采用槳法時(shí)膠囊會(huì)漂浮在液面上，故參照2010年版《中國(guó)藥典》溶出度測(cè)定法第一法（籃法）[8]進(jìn)行測(cè)定。

3.3 轉(zhuǎn)速的選擇

以水為釋放介質(zhì)進(jìn)行本品的釋放度測(cè)定，轉(zhuǎn)速分別選擇50、75、100 r/min，其累積釋放度結(jié)果見圖3。

圖3 單硝酸異山梨酯緩釋膠囊在不同轉(zhuǎn)速下的累積釋放度比較Fig 3 Comparison of accumulative release rate of Isosorbide mononitrate sustained-release capsules at different rotation speeds

由圖3可知，采用以上3種轉(zhuǎn)速，釋放度無(wú)明顯差別，藥物均可釋放完全。綜合考慮以上結(jié)果，確定本品釋放試驗(yàn)轉(zhuǎn)速為50 r/min。

3.4 釋放度均一性及重現(xiàn)性試驗(yàn)

取3批樣品各6粒，采用籃法，以水500 ml為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r/min，水溫（37.5±0.5）℃，分別放入釋放杯中，于1、4、8 h時(shí)取樣10 ml（同時(shí)補(bǔ)充等溫同體積的釋放介質(zhì)），濾過(guò)，作為供試品溶液；另取單硝酸異山梨酯標(biāo)準(zhǔn)品適量，制備成100μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算各樣品在不同時(shí)間點(diǎn)的累積釋放度，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，3批樣品在8 h時(shí)累積溶出度均大于80%，各取樣點(diǎn)RSD 均小于2%（n＝6），表明釋放度均一性和重現(xiàn)性良好。

圖4 3批樣品釋放度均一性和重現(xiàn)性考察結(jié)果Fig 4 Uniformity and reproducibility of release rate for 3 batches of samples

3.5 相似因子（f2）法評(píng)價(jià)釋放曲線

取單硝酸異山梨酯緩釋膠囊自制品與對(duì)照品進(jìn)行釋放度考察，其釋放曲線見圖5。

圖5 自制品與對(duì)照品釋放度比較Fig 5 Comparison of release rate of self-made preparation with reference preparation

采用f2法對(duì)兩條藥物體外釋放曲線進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算公式[9]為：

式中，Rt和Tt分別為各取樣時(shí)間點(diǎn)自制品與對(duì)照品的平均釋放度，n為取樣時(shí)間點(diǎn)個(gè)數(shù)。如果50≤f2≤100，表示兩者相似，在此范圍內(nèi)，f2越大表示越相似。計(jì)算得自制品和對(duì)照品釋放曲線的f2為85.37，可認(rèn)為兩者釋放度相似。

3.6 釋放模型擬合

分別取自制品和對(duì)照品按照“3.4”項(xiàng)下釋放度測(cè)定方法，依法操作，并分別采用一級(jí)方程、Higuchi方程及Weibull[10-11]模型對(duì)二者的體外釋放數(shù)據(jù)即累積釋放度（Q）-時(shí)間（t）進(jìn)行擬合，結(jié)果見表2。

表2 釋放模型擬合結(jié)果Tab 2 Results of release model fitting

將兩種制劑分別用不同釋放模型進(jìn)行擬合，結(jié)果表明兩種制劑的體外釋放行為最符合Higuchi方程。

4 討論

4.1 波長(zhǎng)的選擇[12-13]

本試驗(yàn)最初采用紫外分光光度法測(cè)定單硝酸異山梨酯緩釋膠囊的含量，但空白輔料在主藥的最大吸收波長(zhǎng)處有紫外吸收，而且供試液自身的吸收度值偏低，輔料對(duì)其測(cè)定有一定的影響。為使測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，故建立了專屬性更強(qiáng)的高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。在選擇測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)，最初參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]選用210 nm，但此波長(zhǎng)處甲醇的干擾峰較大，為了避免甲醇的末端吸收，最終選擇測(cè)定波長(zhǎng)為220 nm。

4.2 取樣時(shí)間點(diǎn)的選擇

本試驗(yàn)取樣點(diǎn)的選擇參考國(guó)外進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)[珠海許瓦茲WS1-（X-116）-2006Z][15]，分別為1、4、8 h 3個(gè)取樣點(diǎn)。1 h取樣點(diǎn)用于考察藥物是否有突釋現(xiàn)象，其應(yīng)在38%～50%；4 h 取樣點(diǎn)用于考察釋藥物是否平穩(wěn)釋放，應(yīng)在50%～70%；8 h 取樣點(diǎn)用于考察藥物釋放是否基本完全，釋放度應(yīng)為75%以上。試驗(yàn)最初還選擇了12 h的取樣點(diǎn)，但結(jié)果證明與8 h累積釋放度無(wú)太大差別，故最終確定取樣時(shí)間點(diǎn)為1、4、8 h。

4.3 對(duì)自制品的評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)自制單硝酸異山梨酯緩釋膠囊在不同介質(zhì)及轉(zhuǎn)速條件下的釋放度比較，發(fā)現(xiàn)其在各種釋放條件下差異微小。同時(shí)，通過(guò)與對(duì)照品釋放模型的擬合及f2的比較，表明自制品與對(duì)照品體外釋放行為相似，相關(guān)性良好，并且動(dòng)力學(xué)特征以Higuchi方程擬合較好。

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