陳璐，姚紅娥，李春沁，何春楊，張梅

·藥理毒理·

波棱瓜子提取物在大鼠體內(nèi)分布的初步研究

陳璐，姚紅娥，李春沁，何春楊，張梅

目的：初步了解波棱瓜子提取物在大鼠體內(nèi)的組織分布情況，為進(jìn)一步確定其藥效成分及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：大鼠單次灌胃給予一定劑量的波棱瓜子乙酸乙酯提取部位，分別在給藥后1 h、2 h處死并解剖大鼠，取心、肝、脾、肺、腎、腦六個(gè)組織；采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)比空白組織、給藥組織及體外樣品，對(duì)各組織中移行成分進(jìn)行確定，了解波棱瓜子提取物中各成分在大鼠體內(nèi)的分布狀態(tài)。結(jié)果：大鼠給藥后，肺出現(xiàn)了4個(gè)移行成分，心、肝組織中出現(xiàn)了兩個(gè)移行成分，脾、腎組織在2 h出現(xiàn)了一個(gè)移行成分，腦組織中未有移行成分出現(xiàn)。結(jié)論：波棱瓜子提取物口服給藥后，多種成分均有吸收。給藥后1 h～2 h間，各臟器分布廣泛，其中在肺臟中原型成分積蓄最多，肝臟中出現(xiàn)代謝成分，且藥物進(jìn)入肝、肺臟的速度較快；心、脾、腎中原型成分的積蓄較小，腦組織中未出現(xiàn)任何移行成分，該藥似不能通過血腦屏障。

波棱瓜子；體內(nèi)分布；HPLC

波棱瓜子為葫蘆科波棱瓜屬植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall.（H. pedunculosum (Ser.) Baill）的干燥成熟種子，具有清腑熱，膽熱的功效，用于治療肝、膽熱癥（肝炎，膽囊炎），消化不良等?，F(xiàn)代藥理研究表明波棱瓜子具有抗化學(xué)性肝損傷、抗氧化、抗疲勞及抗腫瘤等作用[1～6]。課題前期對(duì)波棱瓜子的血清藥物化學(xué)進(jìn)行了研究，初步確定了其血漿中的移行成分[7]。本研究在此基礎(chǔ)之上進(jìn)一步探討波棱瓜子在大鼠各組織中的移行成分及分布，為研究波棱瓜子體內(nèi)作用的有效成分、作用機(jī)制及代謝過程奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，18只，體重140～160g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證：SCXK（川）2008-24。

1.2 藥材與試劑

波棱瓜子，2012年9月購于四川甘孜，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與鑒定系裴瑾教授鑒定為葫蘆科植物波棱瓜Herpeto-spermum caudigerum Wall的干燥成熟種子。

甲醇 (成都市科龍化工試劑廠, 分析純 )；甲醇(美國 Fisher公司, 色譜純)； 高純水 (實(shí)驗(yàn)室自制 )；乙腈 (色譜純, 美國 Fisher公司)；磷酸（成都市科龍化工試劑廠, 分析純）；蜂蜜（北京市慈生堂有限公司）。

1.3 儀器

安捷倫 1200高效液相色譜儀；KQ-500DE超聲波清洗機(jī) (昆山市超聲波儀器有限公司)；TGL-16G高速離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠) ； 微型旋渦混合儀 (上海滬西分析儀器長有限公司)；氮?dú)獯蹈蓛x（HGC-1RA）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 波棱瓜子乙酸乙酯提取物的制備 根據(jù)課題前期研究結(jié)果制備供試品[7]：取波棱瓜子粗粉，用 95%乙醇于水浴回流提取 3次, 用 10、8、6倍乙醇分別提取2 h、1.5 h、1.5 h，減壓除去乙醇得浸膏，冷卻。將上層綠色油狀物傾出，棄去，用石油醚洗滌色固體。水分散，用乙酸乙酯萃取 3次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓除去乙酸乙酯，得黃色固體，即為乙酸乙酯提取物。

取波棱瓜子乙酸乙酯部位提取物用甲醇溶解配制成濃度為 1.0 mg．mL-1的溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，得波棱瓜子乙酸乙酯部位供試品溶液。另精密稱定波棱瓜子乙酸乙酯部位適量，放入研缽中研細(xì)后，加入蜂蜜研磨混合，配制成0.375 g．mL-1的混懸液，4℃冷藏，備用。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方案 將18只SD大鼠分為空白組、給藥1 h組及給藥2 h組，每組6只。禁食12 h (自由飲水 )，給藥組灌胃“2.1.1”項(xiàng)下制備的波棱瓜子乙酸乙酯部位蜂蜜混懸液1 mL/100 g，空白組給予相同體積的蜂蜜?？瞻捉M和給藥1 h組大鼠于灌胃后1 h處死，給藥2 h組于灌胃后2 h處死，取心、肝、脾、肺、腎、腦6個(gè)組織。用生理鹽水洗凈，吸干水分，每個(gè)組織稱取0.5 g，分別加入3倍量的生理鹽水制成組織勻漿。

2.1.3 組織樣品的制備 取1 mL組織勻漿加入3倍量甲醇，析出蛋白沉淀，渦旋混勻5 min，離心（10000 r．min-1）15 min，取出上清液，用氮?dú)獯蹈?。?100

μL色譜甲醇溶解剩余物，10000 r．min-1轉(zhuǎn)速離心 5 min ，上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得組織供試品。

2.1.4 色譜條件 采用課題組前期研究建立方法[7]：Phenomenex Luna C18高效液相色譜柱 ( 4.60 mm ×250 mm, 5 μm)；柱溫：25 ℃，檢測波長:230 nm；流動(dòng)相: A (乙腈) , B ( 0.1 %磷酸水溶液)：流速: 0.8 mL．min-1，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.1.5 波棱瓜子乙酸乙酯提取物及組織樣品分析 取波棱瓜子乙酸乙酯提取物供試液10 μL、給藥組織樣品及空白組織樣品各20 μL進(jìn)樣，在相同色譜條件下進(jìn)行分析, 建立HPLC指紋圖譜, 比較空白組織樣品、給藥組織樣品以及體外波棱瓜子乙酸乙酯部位的色譜峰，鑒定組織中的移行成分，探討各成分在組織中的分布狀態(tài)。

2.2 結(jié)果

波棱瓜子提取物給藥后大鼠心組織出現(xiàn)了2個(gè)移行成分（圖1），與體外樣品相比較可知，1、2號(hào)峰為波棱瓜子乙酸乙酯部位中含有的成分，給藥后以原型成分進(jìn)入心臟。兩個(gè)峰的峰面積均隨著時(shí)間的推移有所增加，其中1號(hào)峰更為明顯。肝組織中出現(xiàn)了2個(gè)移行成分（圖2），與體外樣品相比可知，2號(hào)峰為給藥肝組織中出現(xiàn)的代謝成分；1號(hào)峰在空白肝組織、給藥肝組織以及波棱瓜子乙酸乙酯部位樣品中都有出現(xiàn)，但給藥肝組織中該峰面積與空白肝組織相較明顯增大，可能該峰是由藥材中的某成分與組織中固有成分疊加而成，且2 h給藥肝組織中該峰面積較1h給藥肝組織稍有減小。給藥后2 h脾組織中出現(xiàn)了移行成分（圖3），與體外樣品相比較可知，1號(hào)峰可能為給藥后脾組織中的代謝成分，但由于該峰不是單峰，故不能進(jìn)一步具體判斷。肺組織出現(xiàn)了4個(gè)移形成分（圖4），與體外樣品相比較可知，1、2、3、4號(hào)峰均為波棱瓜子乙酸乙酯部位中含有的成分，給藥后以原型成分進(jìn)入肺臟，且4個(gè)峰在給藥2 h肺組織中峰面積均小于1 h肺組織。腎組織中出現(xiàn)1個(gè)移行成分（圖5），與體外樣品比較可知，1號(hào)峰為波棱瓜子乙酸乙酯部位中含有的成分，給藥后以原型成分進(jìn)入腎臟。腦組織中未發(fā)現(xiàn)移形成分（圖6），波棱瓜子提取物中成分似不能透過血腦屏障。

圖1 心組織HPLC圖譜

圖2 肝組織HPLC圖譜

圖3 脾組織HPLC圖譜

圖4 肺組織HPLC圖譜

圖5 腎組織HPLC圖譜

圖6 腦組織HPLC圖譜

3 討論

波棱瓜子提取物原型成分在給藥后1 h-2 h間，在各臟器中分布廣泛，其中在肺臟中原型成分積蓄最多，肝臟中出現(xiàn)代謝成分；心、脾、腎中原型成分的積蓄較小；腦組織中未出現(xiàn)任何移行成分，該藥似不能通過血腦屏障。在給藥后1 h-2 h間，肝臟與肺臟中移行成分含量減小，說明波棱瓜子提取物給藥后活性成分進(jìn)入肝、肺臟較快；心臟與脾臟中移行成分含量增加，說明活性成分進(jìn)入心、脾臟較慢，且含量較低；給藥2 h，腎臟出現(xiàn)原型成分，表明波棱瓜子進(jìn)入血液的原型成分可能在2 h時(shí)已經(jīng)開始排泄。

藥物在體內(nèi)的分布與藥理作用有密切關(guān)系，它決定了藥效的強(qiáng)弱和作用的持續(xù)時(shí)間。本研究表明，波棱瓜子給藥肝臟出現(xiàn)移行成分，含量較心、脾、腎組織高，且活性成分進(jìn)入較快，這一結(jié)果與波棱瓜子具有治療肝膽熱證的作用相符合。但是，結(jié)果同時(shí)表明波棱瓜子提取物中多種原型成分在肺臟中積蓄最多，這與波棱瓜子的傳統(tǒng)藏醫(yī)藥理論，以及目前相關(guān)藥理研究似乎無法聯(lián)系。但藥物分布與藥理作用部位的直接關(guān)系不是絕對(duì)的，分布多的組織．也許并不是表現(xiàn)治療作用的器官，藥物亦可能在體內(nèi)發(fā)生部分轉(zhuǎn)化。所以還需進(jìn)一步探索波棱瓜子發(fā)揮藥理作用的本質(zhì)，將其分布與活性成分的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化及作用機(jī)制研究結(jié)合進(jìn)行。

此外，由于缺乏足夠多的波棱瓜子各化學(xué)成分對(duì)照品，實(shí)驗(yàn)未能對(duì)各組織中移行成分進(jìn)行指認(rèn)及含量測定。擬在進(jìn)一步研究中采用對(duì)照品對(duì)照、文獻(xiàn)比對(duì)、TOF-MS精確分子量測定及數(shù)據(jù)庫檢索等方式對(duì)移行成分進(jìn)行鑒定。

[1] 劉軍,陳興,張伊,等.藏藥波棱瓜子乙酸乙酯部位化學(xué)成分研究[J].中藥與臨床,2010,1(3): 15.

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

Preliminary study on the distribution of Bolengguazi extract in rats

CHEN Lu, YAO Hong-e, LI Chun-qin, HE Chunyang, ZHANG Mei//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China)

Objective:To preliminary investigate the distribution of Bolengguazi extract in rats, and laid the foundation for further research of effective material base and action mechanism.Method:At 1 hour and 2 hours after single dose of Bolengguazi extract was intragastric administered, the rats were executed. The heart, liver, spleen lung, and kidney of rats were collected. Highperformance liquid chromatography ( HPLC ) was used to detect the compounds in tissues by comparing tissue of control group, tissue of group with Bolengguazi and Bolengguazi extract.Result:There were 4 compounds detected in lungs tissue, 2 compounds detected in heart and liver tissue, 1 compound detected in spleen and kidney tissue at 2h, and no compound was detected in brain tissue.Conclusion:There are many components of Bolengguazi absorbed in rats after intragastric administration. At 1 to 2 hour, the components are distributed widely. Higher content of original compounds are found in lungs tissue and metabolites are found in liver tissue. Lower content of original compounds are found in heart, spleen and kidney. And no compound appears in brain tissue, so the medicine is unable to pass the blood-brain-barrier.

Bolengguazi; tissue distribution; HPLC

R 285.5

A

1674-926X(2014)01-008-03

四川省科技支撐項(xiàng)目（2013SZ0114）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

陳璐(1990-)，女，藥物分析專業(yè)碩士研究生

張梅，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥及其復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究Tel:028-61800231 Email: zhangmei63@126.com

2013-06-03