何成軍，耿昭，周勤梅，李小紅，彭成，郭力

·炮制制劑·

HPLC法測定附子不同炮制品、川烏、參附注射液中腺苷的含量

何成軍，耿昭，周勤梅，李小紅，彭成，郭力

目的：首次從附子中分得腺苷，并應用高效液相色譜法建立附子不同炮制品、川烏、參附注射液中腺苷含量的測定方法。方法：采用Diamonsil Cl8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（15:85）；檢測波長：260 nm；流速：1.0 mL/min。結果：腺苷在0.062～0.217 μg范圍內線性關系良好，R=0.9997，平均回收率為99.9%，RSD=2.41%。結論：本方法可靠、準確、簡便，為評價附子不同炮制品、川烏、參附注射液的質量提供了科學依據(jù)。

附子；腺苷；含量測定

附子(Aconiti Lateralis Radix Praeparata)為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品[1]，是川產道地藥材之一，主產于江油市[2]，主要有黑順片、白附片、鹽附子等炮制品。其性辛、甘，大熱；有毒；歸心、腎、脾經；具有回陽救逆、補火助陽、祛風寒濕邪之功，用于亡陽虛脫、肢冷脈微、陽萎、宮冷、心腹冷痛、虛寒吐瀉、陰寒水腫、陽虛外感、寒濕痹痛。附子被歷代醫(yī)家視為補火之要藥，在臨床上的應用十分廣泛。但是現(xiàn)行《中國藥典》中附子、烏頭及其不同炮制品都以脂溶性生物堿為指標成分進行質量控制，而附子在臨床上主要使用水煎液。本課題利用硅膠柱色譜及重結晶等方法從附子的水煎液中分離得到具有廣泛心臟效應的水溶性成分——腺苷，并利用高效液相色譜法對附子及其不同炮制品、川烏、參附注射液中的腺苷進行了含量測定，為其水溶性成分質量控制作補充，使其質量控制更加科學。為附子及其炮制品、川烏及其復方制劑的質量控制和進一步的科學研究提供了參考。

1 實驗材料

生附片（批號：20101001）、川烏（批號：20101001）、白附片（批號：20101001）和黑順片（批號：20101001）購自江油恒源藥業(yè)集團有限公司（經成都中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.及其子根加工品附子的不同炮制品）；參附注射液購自雅安三九藥業(yè)（規(guī)格：10 mL/支，每 1mL相當于含生藥附子0.2 g，批號120204）；腺苷對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：879-200202）。

Agilent 1200 series高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil Cl8(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（15:85）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：260 nm；進樣量：10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取腺苷對照品適量，加甲醇制成1 mL含15.5 μg的溶液作為對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取粉末2.0 g，置具塞錐形瓶中，分別加入0.5%磷酸20 mL，密塞，精密稱定，超聲處理45分鐘，放冷，再精密稱定，用0.5%磷酸液補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液過0.45 μm微孔濾膜后作為供試品溶液，備用。

2.4 檢測波長的選擇

取腺苷對照品溶液適量，于Agilent 1200型高效液相色譜儀二極陣列管(DAD)檢測器下200 nm～400 nm范圍內進行掃描，確定最大吸收波長為260 nm。

2.5 線性關系考察

精密吸取腺苷對照品溶液4、6、8、10、12、14 μl注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件進行峰面積測定。以腺苷的進樣量(μg)作為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y = 4089.6x + 8.3695, r= 0.9997，表明腺苷在0.062 μg～0.217 μg范圍內線性關系良好。見表1，圖1。

表1 腺苷線性范圍考察結果

圖1 腺苷標準曲線圖

2.6 精密度試驗

精密吸取15.5 μg/mL的對照品溶液10 μl，重復進樣5次，按照“2.1”項下色譜條件，記錄峰面積，計算相對標準偏差，RSD為1.01%＜2%，精密度符合要求，儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一腺苷對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，在0、2、4、6、8、10小時注入高效液相色譜儀，記錄其峰面積，計算相對標準偏差，RSD為1.66%＜2%。對照品溶液在10小時內穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批生附片粉末約2.0 g，各5份，分別按照前述供試品溶液制備方法進行樣品溶液的制備，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算相對標準偏差，RSD為2.53%＜5%，表明擬定的方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批生附片粗粉9份，各1.0 g，精密稱定，分別精密加入一定量的對照品儲備溶液（155 μg/mL），按“2.3”項方法制備供試品溶液。按“2.1”項所述色譜條件測定，計算回收率，結果見表2。

表2 腺苷加樣回收率

2.10 樣品的測定

取生附片、黑順片、白附片及川烏藥材粗粉約2.0 g，精密稱定，照“2.3”項下方法制備樣品溶液，參附注射液（每1 mL相當于含生藥附子0.2 g）直接注入高效液相色譜。以上樣品均在“2.1”色譜條件下測定，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 試驗中依次對流動相、提取溶劑、提取方法、提取時間、提取溶劑用量等因素進行了考察。腺苷相對其他成分分離度好、干擾少，專屬性及重現(xiàn)性高，結果準確可靠，可用于附子及其炮制品、川烏、參附注射液的質量控制和分析。

3.2 生附片中腺苷含量最高，川烏、參附注射液中次之，白附片與黑順片幾乎沒有檢出腺苷，主要是由于附子在炮制過程中經過膽巴水浸制、煮、水漂后，腺苷隨炮制過程流失嚴重，并且其本身含量在生附片也較低，因此難以檢出也在情理之中。

3.3 據(jù)文獻報道[3,4]，黑順片和白附片中生物總堿的含量較附片和川烏中生物總堿含量低，說明炮制過程對附子中化學成分有一定的影響。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部) [S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.

[2] 陰鍵, 郭力弓. 中藥現(xiàn)代研究與臨床應用 [M]. 北京:學苑出版社, 1993:391.

[3] 葉定江,原思通. 中藥炮制學辭典 [M].上海:上?？茖W技術出版社, 2005:274.

[4] 王瑞,劉芳,孫毅坤,等. 不同附子炮制品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量的HPLC測定 [J]. 藥物分析雜志, 2006, 26(10):1361.

（責任編輯: 胡慧玲）

Determination of Adenosine in different Aconiti Lateralis Radix Praeparata, Aconiti Radix and Shenfu Injection by HPLC

HE Cheng-jun, GENG Zhao, ZHOU Qin-mei, LI Xiao-hong, PENG Cheng, GUO Li//(Pharmacy College,Chengdu
University of Traditional Chinese Medicine;The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine;State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China)

Objective:The study was aimed to establish a HPLC method for the determination of Adenosine which was isolated from the Aconiti Lateralis Radix for the frst time in different processed products of Aconiti Lateralis Radix Praeparata, Aconiti Radix and Shenfu Injection.Method:The separation of the determination was achieve on a Diamonsil Cl8column (250 mm×4.6 mm，5 μm). The mobile phase was MeOH-phosphate buffer (15:85) at a fow-rate of 1.0 mL．min-1. The detector was set at UV 260 nm.Result:The method had a good linear relationship in the range from 0.062 μg to 0.217 μg (R=0.9997). The average recovery was 99.9% and RSD was 2.41%.Conclusion:The method is reliable, stable, simple and can be used to evaluate the quality of different processed products of Aconiti Lateralis Radix Praeparata, Aconiti Radix and Shenfu Injection.

Aconiti Lateralis Radix Praeparat; adenosine; determination

R 282.71

A

1674-926X(2014)01-004-03

“十二五”國家科技支撐計劃課題(No. 2010BAE00406)

成都中醫(yī)藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

何成軍（1989- ），男，在讀碩士研究生，從事中藥質量標準化研究Tel:13699449413 Email:heye1217@163.com

彭成（1964- ），男，教授，博士生導師，從事疾病動物模型與中藥藥理毒理研究Email:pengchengchengdu@126.com

2013-06-08