葉 強(qiáng)， 劉雨詩(shī)， 劉紅梅， 劉娟汝， 唐雪梅， 郭 力?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137；2.江油市中醫(yī)醫(yī)院，四川江油621700）

附子Aconiti Lateralis Radix Praeparata為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品［1］，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛的功效。其味辛、甘、大熱，有毒［2］，臨床上常以其炮制品入藥，目的是為了減毒增效［3-4］。附子的炮制歷史悠久，炮制方法較多，涵蓋炮、炙、浸、蒸、煮、燒、炒等70余種工藝［5-7］。2015年版 《中國(guó)藥典》收載附子炮制品種包括鹽附子、黑順片、白附片、淡附片、炮附片［1］，均使用膽巴作為炮制輔料。膽巴本身具有一定毒性［8］，經(jīng)膽巴制后的附子易引入無(wú)機(jī)雜質(zhì)，炮制后需經(jīng)過(guò)反復(fù)漂洗，有效成分極可能在漂洗退膽的過(guò)程中大量流失［9］。

附子經(jīng)過(guò)炮制后毒性降低，本課題組從化學(xué)成分變化的角度出發(fā)，以市場(chǎng)上廣泛流通的加膽、加硫炮制的膽附片 （白附片、熟附片）以及部分地區(qū)流通的無(wú)膽附片 （生附片、蒸附片、炒附片）［10-12］為研究對(duì)象，采用酸性染料比色法測(cè)定總生物堿含有量、高效液相色譜法測(cè)定不同類型生物堿類成分含有量，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)［13］，探討不同炮制工藝、炮制輔料對(duì)附子生物堿類成分的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試藥 Ethos Tos微波消解萃取儀 （意大利 Milestone公司）；Satorious BP221S系列電子分析天平 （德國(guó)Satorious公司）；PHS-3C型PH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；UV-2550紫外分光光度計(jì)、LC-10 A高效液相色譜儀 （日本島津公司）；UPT-Ⅱ-107-優(yōu)普系列超純水器 （成都超純科技有限公司）。

烏頭堿 （AC，批號(hào) 17022206）、次烏頭堿（HAC，批號(hào)17111310）、新烏頭堿 （MAC，批號(hào)16032504）、苯甲酰烏頭原堿 （BAC，批號(hào)16012815）、苯甲酰次烏頭原堿 （BHAC，批號(hào)15010806）、苯甲酰新烏頭原堿 （BMAC，批號(hào)17022806），購(gòu)自成都曼思特生物科技公司，經(jīng)HPLC面積歸一化法計(jì)算含有量＞98%。乙腈 （美國(guó)Fisher公司）；四氫呋喃 （成都科隆化工試劑廠）為色譜純；乙酸銨、溴甲酚綠、二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、冰乙酸、甲酸、氨水為分析純；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 藥材 共收集7個(gè)廠家 （A-G），22批附子樣品，見(jiàn)表1。

1.3 附子炮制品制備［1，14］

1.3.1 生附片 取泥附子，洗凈，去皮，切片，干燥。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.3.2 白附片 取泥附子，洗凈，浸入膽巴水溶液中數(shù)日，連同浸液煮至透心，撈出，剝?nèi)ネ馄?，縱切成厚約0.3 cm的片，用水浸漂，取出，蒸透，曬干。

1.3.3 熟附片 取泥附子，洗凈，浸入膽巴水溶液中數(shù)日，連同浸液煮至透心，撈出，剝?nèi)ネ馄ぃ谐珊窦s7 mm的片，用水浸漂，取出，蒸至透心，出現(xiàn)油面光澤，曬干或烘干。

1.3.4 炒附片 將中等細(xì)度的河砂投入炒藥機(jī)內(nèi)，炒至滑利，投入生附片，砂炒至外表皮黃棕色，斷面黃色，取出，迅速篩去砂子，晾涼。

1.3.5 蒸附片 取生附片，用清水浸潤(rùn)，加熱蒸至附子表面出現(xiàn)油面光澤，干燥。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿測(cè)定［15-16］

2.1.1 溴甲酚綠溶液制備 取乙酸銨約27 g，精密稱定，置于1 000 mL量瓶中，加超純水900 mL溶解，加冰乙酸調(diào)節(jié)pH至6.1±0.1，加超純水至刻度，搖勻，備用。再取溴甲酚綠約5 g，精密稱定，加0.05 mol／L氫氧化鈉溶液17.5 mL充分研磨使溶解，轉(zhuǎn)移至1 000 mL量瓶中，再加乙酸-乙酸銨緩沖液稀釋至刻度，過(guò)濾，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取附子樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置微波消解罐中，加入0.5%甲酸溶液40 mL，密閉，放入微波消解儀中，提取12 min（90℃，800 W）。取續(xù)濾液10 mL，用氨水調(diào)pH 10～11，氯仿萃取5次，每次10 mL，第1次萃取后放置30 min，其余每次放置10 min，合并萃取液，35℃減壓濃縮蒸干，用氯仿溶解并定容至5 mL量瓶中，備用。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取烏頭堿對(duì)照品7.08 mg，于50 mL量瓶中，加氯仿溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為0.141 6 mg／mL的對(duì)照品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.1.4.1 波長(zhǎng)選擇 取烏頭堿對(duì)照品溶液及供試品溶液適量，置于分液漏斗中，加入氯仿補(bǔ)足15 mL，再加入10 mL溴甲酚綠溶液，劇烈振搖3 min，靜置30 min，取氯仿層，用紫外分光光度計(jì)在300～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，均在403 nm處有最大吸收，故選取403 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 mL，分別置于分液漏斗中，加入氯仿補(bǔ)足15 mL，再加入溴甲酚綠溶液10 mL，劇烈振搖3 min，靜置30 min，分層，同法制備溶劑空白溶液，取氯仿層溶液于403 nm處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），吸光度為縱坐標(biāo) （Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝26.079X－0.027 1， R2＝0.999 7， 表明烏頭堿在2.832～47.2 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好

2.1.5 總生物堿含有量測(cè)定 精密量取 “2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液2 mL置分液漏斗中，加氯仿補(bǔ)足15 mL，再加入溴甲酚綠溶液10 mL，劇烈振搖3 min，靜置30 min，取下層液，于403 nm處測(cè)定，見(jiàn)表2。

表2 各樣品總生物堿含有量測(cè)定結(jié)果 （%）Tab.2 Results of content determination of total alkaloids of various samples（%）

2.2 酯型生物堿含有量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液制備 取附子樣品粉末 （過(guò)3號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，水溫25℃以下）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯 （1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤氘惐?二氯甲烷 （1∶1）混合溶液3 mL溶解，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品適量，精密稱定，加異丙醇-二氯甲烷 （1∶1）混合溶液制成混合對(duì)照品溶液，即得，質(zhì)量濃度分別為 45.4、43.2、46.4、47.4、 41.6、 40.6 μg／mL。

2.2.3 色譜條件 DikmaDianonsil C18柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-四氫呋喃 （25∶15）（A）-0.1 mol／L醋酸銨溶液 （B）， 梯度洗脫， 程序見(jiàn) 表 3； 檢 測(cè) 波 長(zhǎng) 235 nm； 體 積 流 量1.0 mL／min； 柱溫 30 ℃； 進(jìn)樣量 10 μL。

表3 梯度洗脫程序Tab.3 Gradient elution programs

2.2.4 樣品含有量測(cè)定 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，注入液相色譜儀，在 “2.2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算酯型生物堿含有量，見(jiàn)表4。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表4 各樣品酯型生物堿含有量測(cè)定結(jié)果 （mg／mL）Tab.4 Results of content determination of ester alkaloidof various samples （mg／mL）

2015年版 《中國(guó)藥典》［1］規(guī)定黑順片、白附片雙酯型生物堿含有量以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿之和計(jì)不得過(guò)0.020%，單酯型生物堿含有量以苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿之和計(jì)不得少于0.010%。《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》［14］規(guī)定生附片雙酯型生物堿含有量以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿之和計(jì)為0.10%～0.25%，熟附片、蒸附片、炒附片不得超過(guò)0.020%；熟附片單酯型生物堿以苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿之和計(jì)不得少于0.010%，蒸附片、炒附片為0.010～0.130%。

3 討論與結(jié)論

3.1 生附片生物堿含有量分析 從總生物堿含有量變化上，江油產(chǎn)生附片總生物堿的含有量為0.580%～0.790%，其中生附片 （去皮）的含有量最高，達(dá)到0.790%，云南產(chǎn)生附片的含有量最低，為0.490%。從酯型生物堿含有量變化，江油產(chǎn)生附片的單酯型生物堿含有量為0.020 1%～0.042 4%，云南產(chǎn)生附片為0.014 9%，單酯型生物堿的含有量以江油產(chǎn)較高，云南產(chǎn)較低；江油產(chǎn)生附片雙酯型生物堿含有量為0.080 3%～0.170 5%，云南產(chǎn)生附片含有量最高為0.195 7%，雙酯型生物堿含有量以云南產(chǎn)較高，江油產(chǎn)較低。見(jiàn)圖2。

圖2 不同產(chǎn)地生附片生物堿類成分對(duì)比Fig.2 Comparison of alkaloids in raw monkhood from different areas

江油為附子的道地產(chǎn)區(qū)，其生附片總生物堿含有量高，而雙酯型生物堿含有量低，云南生附片總生物堿含有量低，但雙酯型生物堿含有量高，從毒與有效成分來(lái)看，江油生附片的質(zhì)量?jī)?yōu)于云南產(chǎn)的生附子。

此外，生附片去皮后總生物堿含有量增高，表明附片皮部中總生物堿含有量較低，因此去皮炮制，富集有效部位，提高附子炮制品的總生物堿含有量，為附子的炮制提供了新思路。

3.2 白附片產(chǎn)地與炮制工藝分析

3.2.1 產(chǎn)地影響 從總生物堿含有量變化上，江油產(chǎn)白附片總生物堿含有量為0.07%～0.23 0%，云南產(chǎn)白附片含有量為0.244%～0.440%，陜西產(chǎn)白附片含有量為0.128%，即總生物堿含有量云南產(chǎn)＞江油產(chǎn)＞陜西產(chǎn)，其中云南產(chǎn)無(wú)膽白附片（D2）含有量最高，達(dá)到0.440%。從酯型生物堿含有量變化上，江油產(chǎn)單酯型生物堿白附片含有量為0.010 1% ～0.015 8%，云南產(chǎn)含有量為0.032 6%～0.121 5%，陜西產(chǎn)含有量為0.023 0%，即單酯型生物堿含有量為云南產(chǎn)＞陜西產(chǎn)＞江油產(chǎn)，其中最高者為云南產(chǎn)無(wú)膽白附片；江油產(chǎn)白附片雙酯型生物堿含有量為0.000 8%～0.003 4%，云南產(chǎn)含有量為0.007 1%～0.019 9%，陜西產(chǎn)含有量為0.015 3%，即雙酯型生物堿含有量為云南產(chǎn)＞江油產(chǎn)＞陜西產(chǎn)，含有量最高者亦為云南無(wú)膽白附片。見(jiàn)圖3。

圖3 白附片生物堿類成分對(duì)比Fig.3 Comparison of alkaloid components in white monkshood

3.2.2 炮制工藝影響 無(wú)膽白附片［17］的炮制工藝為泥附子凈制、煮制、切片、蒸制、干燥，不經(jīng)膽巴炮制、流水漂洗；無(wú)膽白附片的總生物堿、單酯型生物堿含有量均高于傳統(tǒng)膽巴炮制白附片，同時(shí)毒性成分雙酯型生物堿含有量也顯著高于傳統(tǒng)白附片，存性效果較好，而去毒能力不足；傳統(tǒng)膽巴炮制白附片工藝相對(duì)復(fù)雜，但在保證藥效的基礎(chǔ)上，去毒能力較強(qiáng)。因此，無(wú)膽炮制白附片工藝雖具有一定可取之處，但不能完全取代傳統(tǒng)膽巴炮制，白附片的無(wú)膽巴炮制工藝有待進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化。

3.3 蒸制工藝影響 白附片總生物堿含有量為0.070%～0.440%，熟附片總生物堿含有量為0.110%～0.130%；白附片單酯型生物堿含有量為0.010 1%～0.121 5%，熟附片單酯型生物堿含有量為0.011 0%～0.012 4%；白附片雙酯型生物堿含有量為0.001 2%～0.022 1%，熟附片雙酯型生物堿含有量0.001 0%～0.006 3%；白附片的總生物堿、酯型生物堿含有量均高于熟附片。見(jiàn)圖4。

圖4 白附片與熟附片生物堿類成分對(duì)比Fig.4 Comparison of alkaloid content between white and cooked monkshood

白附片與熟附片的炮制工藝相似，但蒸制時(shí)間存在差異，熟附片蒸制較長(zhǎng)，需蒸至附片表面呈油性光澤。熟附片總生物堿、酯型生物堿含有量均低于白附片，可能蒸制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成生物堿類成分流失。

3.4 蒸、炒工藝影響 相比于白附片、熟附片，蒸附片、炒附片的總生物堿與單酯型生物堿的含有量均較高，雙酯型生物堿含有量均較低，其中總生物堿含有量蒸附片較高，單酯型生物堿含有量炒附片較高，雙酯型生物堿含有量在兩種附片中差異不大。見(jiàn)圖5。

圖5 蒸附片與炒附片生物堿類成分對(duì)比Fig.5 Comparison of alkaloid content between steamed and fried monkshood

3.4.1 漂洗影響 蒸附片與炒附片不經(jīng)膽巴炮制與漂洗，工藝簡(jiǎn)單，總生物堿及單酯型生物堿含有量均高于白附片、熟附片 （有膽）的平均水平，其總生物堿的保留率較高，雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化率也較高。白附片、熟附片為膽巴炮制附片，炮制過(guò)程中經(jīng)膽巴水浸泡，后用流水反復(fù)漂洗退膽，推測(cè)漂洗工藝可能會(huì)造成附子中生物堿類成分大量流失。

3.4.2 無(wú)膽炮制附子工藝優(yōu)勢(shì) 2015年版 《中國(guó)藥典》規(guī)定，采用膽巴水浸泡、煮、漂洗退膽、蒸等系列工序炮制附子，工藝繁瑣，盡管能有效去毒，但漂洗退膽過(guò)程中損失有效成分而存性不足，同時(shí)易引入膽巴中的無(wú)機(jī)雜質(zhì)；而無(wú)膽蒸制、炒制附子炮制工藝簡(jiǎn)單，去毒存性且不易引入無(wú)機(jī)雜質(zhì)。蒸附片、炒附片現(xiàn)收載于 《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》，主要流通于四川當(dāng)?shù)兀瑸榈胤窖赜闷贩N，從化學(xué)成分及臨床反饋看，炮制工藝優(yōu)勢(shì)明顯，建議 《中國(guó)藥典》 增加蒸制和炒制工藝［18-19］。3.5 總結(jié) 以生物堿類成分的平均含有量對(duì)比附子不同炮制品的差異，見(jiàn)圖6。

圖6 附子不同炮制品生物堿含有量對(duì)比Fig.6 Comparison of alkaloid content in different processed products of monkshood

附子各炮制品中總生物堿含有量以生附片最高，其次是蒸附片和炒附片，含有量較低的為白附片及熟附片，即生附片＞蒸附片＞炒附片＞白附片＞熟附片。相比生附片，炮制后的附片單酯型生物堿含有量明顯升高，雙酯型生物堿含有量明顯降低，單酯型生物堿與雙酯型生物堿含有量占比發(fā)生改變，各炮制品中，單酯型生物堿含有量為炒附片＞蒸附片＞白附片＞生附片＞熟附片，雙酯型生物堿含有量為生附片＞白附片＞蒸附片＞炒附片＞熟附片。檢測(cè)分析表明，不同的炮制方法，能不同程度的降低附子中毒性成分雙酯型生物堿的含有量，增加有效成分單酯型生物堿的含有量，達(dá)到增效減毒的目的。