王海梅，董慶利*，劉 箐，胡孟晗，姚 遠

（上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

不同場景下冷卻豬肉中氣單胞菌到小青菜的交叉污染

王海梅，董慶利*，劉 箐，胡孟晗，姚 遠

（上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

為了定量分析廚房內(nèi)冷卻豬肉中氣單胞菌（Aeromonas spp.）在案板、刀具、 手以及小青菜之間的交叉污染水平，采用一定方式將氣單胞菌接種于精腿肉中，模擬消費者在廚房中食物準備過程，對豬肉進行分割，分別測定氣單胞菌到案板、刀具、手的轉移率；同時，測定6 種設定場景下接種于3 種介質表面的氣單胞菌到小青菜的轉移率，并通過對數(shù)轉換后進行頻數(shù)分布擬合。此外，以場景1即切過豬肉后各介質不做任何處理的情況為例對交叉污染進行仿真模擬。結果表明：各組轉移率在一定范圍內(nèi)變化且差異顯著，經(jīng)對數(shù)轉換后的轉移率符合或接 近正態(tài)分布。交叉污染的仿真模擬證實，若食用產(chǎn)生交叉污染的豬肉和蔬菜將存在一定的風險，再結合 烹飪階段的評估以及劑量-反應關系研究，可為構建完整氣單胞菌風險評估體系提供理論參考。

冷卻豬肉；小青菜；氣單胞菌；交叉污染；轉移率

食品安全是世界性公共安全問題，致病菌是引起食源性疾病的重要原因之一[1]。氣單胞菌（Aeromonas spp.）是冷卻豬肉中常見優(yōu)勢腐敗菌之一[2]，同時被證實是一種可導致胃腸炎和敗血癥的人畜共患致病菌[3-4]。近年關于氣單胞菌引起食源性疾病的報道日益增多[5-7]，為降低病原菌造成的危害，監(jiān)測其生長及變化規(guī)律變得尤為重要。在已有冷卻豬肉中氣單胞菌的暴露評估研究中，以其一級和二級生長模型為基礎[8]，并以銷售、運輸以及貯藏階段的時間和溫度為主要影響因素來評估豬肉最終污染水平和食用的風險[9]，并 未涉及廚房內(nèi)交叉污染環(huán)節(jié)。據(jù)調研表明，約40%～60%的食源性疾病與消費者在廚房內(nèi)食物準備過程中不恰當?shù)牟僮餍袨橛嘘P[10-11]。國外關于交叉污染的研究常以沙門氏菌（Salmonella）[12-14]、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）[15]、空腸彎曲桿菌（Campylobacter）[16-17]等為對象，且多集中于對交叉污染的來源和途徑[16]、轉移率影響因素[18-19]等方面的認識。氣單胞菌作為冷卻豬肉中優(yōu)勢腐敗菌之一，在豬肉腐敗過程中起到關鍵性作用[20]，對氣單胞菌在廚房內(nèi)的交叉污染進行研究十分必要。

本實驗模擬消費者在廚房內(nèi)準備食物過程中常見的6 種場景，測定氣單胞菌在豬肉、案板、刀具、手和小青菜之間的轉移，根據(jù)公式計算各組轉移率，并選用Origin8.0軟件對經(jīng)對數(shù)轉換的轉移率進行頻數(shù)分布擬合。此外，采用@Risk5.5軟件中蒙特卡羅（Monte Carlo）抽樣方法對交叉污染進行仿真模擬，可為構建完整氣單胞菌風險評估體系提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

購于上海卜蜂蓮花超市優(yōu)質金鑼精腿豬肉和小青菜，被迅速置于0～4 ℃冰箱中冷藏備用。

平板培養(yǎng)所用氣單胞菌培養(yǎng)基基礎（RYAN），購于青島海博生物技術有限公司；氣單胞菌液體培養(yǎng)基配制參照文獻[21]。

1.2 菌種選用、活化及菌懸液的制備

氣單胞菌（CICC 23564）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，于27 ℃條件下置于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，用接種環(huán)蘸取原菌液進行平板劃線，活化3 次。挑取長勢較好的單菌落接種于200 mL氣單胞菌液體培養(yǎng)基，在27 ℃條件下培養(yǎng)18 h，使菌液濃度達到8（lg（CFU/mL））。

1.3 介質接種及帶菌量測定

在超凈工作臺內(nèi)稱取25 g肉樣置于潔凈玻璃器皿表面，用無菌槍頭將0.5 mL菌懸液涂布于肉樣表面，為使氣單胞菌較均勻地黏附在肉樣表面，借用無菌鉗將肉塊翻動數(shù)次后將其靜置10 min。在6 種場景下，案板、刀具和手表面亦采用表面涂布的方式獲得一定初始污染水平，接種量及接種區(qū)域見表1。

接種肉樣的初始污染水平和小青菜的最終帶菌量按國標法GB4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[22]進行定量。案板、刀具、手的初始污染水平根據(jù)測定的菌懸液的濃度通過簡單計算可得。被轉移到案板、刀具、手表面的氣單胞菌則采用擦拭取樣法進行定量測定[23]。

表1 不同場景下案板、刀具、手的接種和處理方式Table1 Inoculation and subsequent treatment of cutting boards, knives, hands under different scenarios

1.4 場景設計及介質滅菌方式

將接種肉樣置于無菌案板5 cm×5 cm區(qū)域內(nèi)，用無菌刀具切割10 次，進而測定被轉移到案板、刀具和手表面的氣單胞菌數(shù)量，每組實驗重復10 次。

測定接種案板、刀具、手表面氣單胞菌向小青菜的轉移率時，設定了6 種在食物準備過程中常見的場景[24-26]，各場景下介質接種方式以及接種后處理方式見表1，每組實驗重復8次。

實驗開始之前，案板、刀具、手和小青菜均需采取相應措施進行滅菌處理，具體方式見表2，其中案板、手所采用的滅菌方式經(jīng)過多次實驗驗證后可行。

表2 各介質滅菌方式Table2 Sterilization methods of different items

1.5 轉移率的測定及分布擬合

應用Microsoft Excel對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，根據(jù)公式（1）計算每組轉移率[28]，并采用SPSS18.0軟件對不同組轉移率進行顯著性檢驗。

式中：T為轉移率；N0為細菌供體表面帶菌量/（CFU/g或CFU/cm2）；Nr為細菌受體表面帶菌量/（CFU/g或CFU/cm2）。

轉移率經(jīng)對數(shù)轉換并以0.25為間隔對其進行歸類，以特定數(shù)值出現(xiàn)頻數(shù)為縱坐標，采用Origin 8.0軟件進行頻數(shù)分布擬合。

1.6 交叉污染的仿真模擬

冷卻豬肉中氣單胞菌在進行廚房操作前的初始污染水平，根據(jù)董慶利等[9]對冷卻豬肉中氣單胞菌從銷售至家庭貯存階段的定量暴露評估進行確定，并將場景1實驗所得各組轉移率采用@Risk5.5軟件進行最佳分布 擬合，結果見表3，并采用蒙特卡羅（Monte Carlo）抽樣方法對各個參數(shù)進行模擬，用概率分布的形式描述小青菜最終污染水平。

表3 交叉污染仿真模擬過程中各參數(shù)的設置Table3 Parameter settings for cross-contamination analogue simulation

2 結果與分析

2.1 氣單胞菌轉移率

轉移率可被定義為一個細菌從供體表面通過相互接觸轉移到受體表面的概率[29]。冷卻豬肉中氣單胞菌到案板、刀具和手的轉移率的平均值、標準差以及變化范圍見表4，豬肉在切割過程中，氣單胞菌被轉移到三者表面的可能性大小的平均值及變化范圍分別為16.35%（1.74%～36.57%）、1.16%（0.62%～2.85%）、12.37%（4.01%～45.70%）。經(jīng)SPSS 18.0軟件顯著性檢驗可知，TMB和TMH無顯著性差異（P＞0.05），而TMK與TMB、TMH均存在顯著性差異（P＜0.05）?？梢?，豬肉中氣單胞菌被轉移到刀具的可能性明顯小于被轉移到案板和手的可能性。

表4 冷卻豬肉中氣單胞菌到案板、刀具和手的轉移率（x±s）Table4 Transfer rates of Aerommoonnaass spp. from chilled pork to cutting boards, knives and hands ((x±s)

在6 種不同場景下，接種于案板、刀具和手表面的氣單胞菌在小青菜切割過程中被轉移的狀況見表5。在場景1時，即在實際操作過程相當于切過冷卻豬肉后案板、刀具、手不做任何清洗而直接用來切割小青菜，此時三介質表面氣單胞菌到小青菜的轉移率及變化范圍分別為18.59%（6.41%～34.84%）、5.30%（1.12%～13.10%）、8.86%（3.16%～16.89%）。在場景2時，接種過氣單胞菌的三介質分別用500 mL無菌水進行沖洗后切割小青菜，此時轉移率及變化范圍分別為0.38%（0.10%～0.81%）、0.09%（0.01%～0.24%）、0.43%（0.12%～1.79%）。在場景6時，小青菜中僅能檢測到極少量氣單胞菌的存在（＜10 CFU/g），各組轉移率接近或等于零。場景3、4、5在食物準備過程中分別相當于切割冷卻豬肉后及時更換案板、更換刀具和徹底清洗手，由表5可知，刀具和手、案板和手、刀具和案板表面氣單胞菌到小青菜轉移率平均值分別16.5%、25.72%、27.07%，變化范圍分別為5.85%～38.49%、11.19%～46.05%、11.85%～69.42%。不同之組轉移率的顯著性檢驗見表5。

表5 不同場景下案板、刀具和手表面氣單胞菌到小青菜的轉移率Table5 Transfer rates of Aerommoonnaass spp. from cutting boards, knives and hands to B. chinensis under different scenarios

2.2 轉移率的頻數(shù)分布擬合

圖1 豬肉中氣單胞菌到案板、刀具、手的轉移率的百分數(shù)對數(shù)值的頻數(shù)分布Fig.1 Frequency distribution of the lg T% of Aeromonas spp. from chilled pork to cutting boards, knives and hands

從豬肉中氣單胞菌到案板、刀具和手的轉移率經(jīng)對數(shù)轉換的頻數(shù)分布擬合結果圖1可知，豬肉中氣單胞菌到刀具的lg T以0.25為間隔進行歸類后，在10 次重復實驗中，-0.25、0、0.25、0.5出現(xiàn)的次數(shù)分別為2、6、1、1 次。豬肉中氣單胞菌到案板和手表面的轉移率的對數(shù)值相對分散且右移，表明這兩組轉移率較高且變化范圍大，近乎重疊的圖形再次證明兩組轉移率無顯著性差異。

圖2 不同場景下案板、刀具、手表面氣單胞菌到小青菜轉移率百分數(shù)對數(shù)值的頻數(shù)分布Fig.2 Frequency distribution of the lg T% of Aeromonas spp. from cutting boards, knives and hands to B. chinensis

5 種場景下案板、刀具、手表面的氣單胞菌到小青菜的轉移率經(jīng)對數(shù)轉換后的頻數(shù)分布擬合如圖2所示，在1、2、3、5場景時，lgT較大且集中，場景2下lgT則相對較小。從頻數(shù)分布擬合圖可知轉移率并非毫無規(guī)律，經(jīng)對數(shù)轉換后通常符合或接近正態(tài)分布，并且從圖中可知lgT最可能出現(xiàn)的數(shù)值及概率，據(jù)此可推斷氣單胞菌從供體表面經(jīng)交叉污染被轉移到受體表面的最大可能性。

2.3 交叉污染的仿真模擬

冷卻豬肉中氣單胞菌經(jīng)過銷售、運輸和貯存階段后污染水平為見圖3，污染范圍從-0.8（lg（CFU/g））（5%置信水平）至7.6（lg（CFU/g））（95%置信水平）。

圖3 豬肉中氣單胞菌的初始污染水平Fig.3 Initial contamination level of Aeromonas spp. in chilled pork

將表3中各參數(shù)作為輸入變量，以小青菜中氣單胞菌最終污染水平作為輸出變量，采用@Risk軟件進行10 000 次蒙特卡羅模擬，得到的結果如圖4所示，小青菜污染水平從-0.08（lg（CFU/g）） （5%置信水平）至1.44（lg（CFU/g））（95%置信水平），均值為0.41（lg（CFU/g））。此結果表明，豬肉中部分氣單胞菌經(jīng)案板、刀具和手轉移到小青菜，并且小青菜中出現(xiàn)較高帶菌量的情況時有發(fā)生，如超過5（lg（CFU/g））的可能性為0.1%。

圖4 小青菜中氣單胞菌的污染水平Fig.4 Contamination level of Aeromonas spp. on B. chinensis

3 結論與討論

致病菌在食物接觸表面?zhèn)鬟f產(chǎn)生的交叉污染是引起食品安全事故的重要因素之一。本實驗模擬豬肉、小青菜為代表的豬肉沙拉的準備過程，定量分析了不同場景下氣單胞菌在各介質間的傳遞率，但研究中存在一定的不足。在實驗過程中，豬肉及各介質保持較高的污染水平，但實際情況并非如此，而初始接種量與轉移率負相關[18]，因此實驗所得數(shù)據(jù)存在一定的局限，若使初始接種量多樣化，轉移率的測定將更具代表性。此外，豬肉在接菌前未進行滅菌處理，其本身含有的氣單胞菌會對實驗結果造成一定程度的影響，但以往采用的熱漂方式（70 ℃，40 s）[12]因較大程度破壞表面肉質影響轉移率的測定從而更不可取，因此尋求合適的方式對豬肉進行滅菌在交叉污染的研究中十分重要。

上述結果表明，同一組轉移率并非固定值，不同組轉移率的平均值和標準差也存在差異，造成此結果的因素較多。Dawson等[30]認為接觸時間的增加能一定程度提高轉移率，Vorst等[31]的研究表明，壓力與轉移率顯著正相關，然而在不同的實驗重復時，兩表面接觸的時間和壓力并不完全一致，從而造成轉移率的變異性。此外，實驗方法自身存在的缺陷也導致轉移率不斷變化。本實驗采用擦拭取樣法對介質表面的氣單胞菌進行定量，然而該方法并不能將介質表面的細菌全部采集并進行計數(shù)，從而使得實驗所測轉移率較實際情況偏低；平板計數(shù)法是最常見菌落計數(shù)方式之一，但在較低的平板計數(shù)時存在的誤差較大，并且誤差隨稀釋倍數(shù)的增大而更加顯著[32]，以上因素均是轉移率變異性的重要來源。接觸表面的理化性質對轉移率的影響也不容忽視，本研究中豬肉中氣單胞菌到不銹鋼刀具的轉移率以及刀具表面氣單胞菌到小青菜的轉移率平均值相對較低（分別為1.16%、5.30%（場景1）），可見不銹鋼刀具的光滑表面并不利于氣單胞菌的轉移，而以相對粗糙的案板和手為研究對象時，得到的轉移率較高，此結果與Vorst等[31]觀點一致，后者認為較粗糙的表面因摩擦力的存在有利于細菌的轉移。同時，本研究在6 種不同場景下介質表面的氣單胞菌向小青菜轉移率的測定結果表明，更換案板（16.50%）、更換刀具（25.72%）、僅僅清洗手（27.07%）等措施，均不能有效控制交叉污染的水平，用適量的水清洗案板、刀具和手則能較大程度減少交叉污染（此時TBL、TKL、THL均值分別為0.38%、0.09%、0.43%），但并未能完全消除細菌被轉移的可能性。若清洗時加入一定的洗潔精并用鐵絲球擦拭，交叉污染發(fā)生的可能性極低，此時轉移率接近或等于零。如何有效控制交叉污染水平也是國外研究的熱點，如Scott等[33]的研究表明，一些致病菌在潮濕的器具表面時生存能力較強且更易被轉移，因此保持廚房器具以及清潔用品的干燥有很大的實際意義。此外，選擇合適的廚房用具也很重要，Koo等[34]比較了棉布、超細纖維布、洗滌布、非紡織物、毛巾布這5 種材質的清潔布的除菌能力，結果表明棉布在實驗中表現(xiàn)最好。Soares等[27]證實木質案板表面的致病菌最難去除，而不銹鋼的案板最易清洗。這些研究為消 費者如何有效減少廚房中的交叉污染提供正確的理論指導。

交叉污染的仿真模擬表明，因交叉污染生鮮豬肉中氣單胞菌被部分轉移，導致蔬菜有一定的污染水平，若蔬菜在食用前不經(jīng)烹飪且豬肉在烹飪時有部分氣單胞菌殘留，則會導致一定的食用風險。然而，現(xiàn)有文獻中缺少氣單胞菌劑量-效應模型的相關報道，因此并不能精確推斷其中的風險。

本實驗對豬肉中氣單胞菌經(jīng)案板、刀具和手到小青菜的交叉污染的定量分析表明，每組轉移率并非固定值且變化顯著，交叉污染對于豬肉沙拉中氣單胞菌的最終污染水平有較大影響，若切割生鮮豬肉后采取恰當清洗方式對接觸介質進行清洗，則能有效減少或拒絕交叉污染。此外，本實驗有助于更清晰地認識交叉污染的來源、途徑及影響，并為構建完整的氣單胞菌風險評估體系提供一定理論參考。

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Cross-Contamination of Aeromonas spp. from Chilled Pork to Brassica chinensis under Different Food-Handling Scenarios

WANG Hai-mei, DONG Qing-li*, LIU Qing, HU Meng-han, YAO Yuan
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

The purpose of this work was to quantify the cross-contamination of Aeromonas spp. from ch illed pork to Brassica chinensis through cutting boards, knives and hands in the kitchen. Transferring experiments were performed to mimic the food preparation process of consumer under laboratory conditions. The pork sample was inoculated with A. spp. before splitting to determine the transfer rate of Aeromonas spp. from chilled pork to cutting boards, knives and hands, respectively. Meanwhile, transfer rates from cutting boards, knives and hands to B. chinensis under various food- handling scenarios were also determined. Transfer rates were logarithmically transformed to fit distributions and take scenario 1(after cutting pork, cutting boards, knives and hands were also used for cutting B. chinensis without any cleaning) as an example to s imulate cross-contamination. The results showed that each set of transfer rates varied significantly over experiments (P ＜ 0.05), and transfer rates with logarithmic transformation proved to be approximately normally distributed. The analogue simulation of cross-contamination showed the cross-contamination of foodborne pathogens from raw meats to ready-to-eat foods suggesting some potential risks to consumers. Combined with cooking stage assessment and dose-response relationship, these results could provide theoretical references for complete establishment of Aeromonas spp. risk assessment.

chilled pork; Brassica chinensis; Aeromonas spp.; cross-contamination; transfer rate

TS 201.3

A

1002-6630（2014）21-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201421038

2013-10-19

國家自然科學基金面上項目（31271896；31371776）；上海市自然科學基金項目（12ZR1420500）

王海梅（1989—），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品安全與質量控制。E-mail：wanghaimei1017@126.com

*通信作者：董慶利（1979—），男，副教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品安全和質量控制。E-mail：dongqingli@126.com