于方園，岳喜慶*，武俊瑞，田 野

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

氨基酸分析儀檢測牛乳中摻入的大豆蛋白

于方園，岳喜慶*，武俊瑞，田 野

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

利用氨基酸分析儀對牛乳和大豆分離蛋白中的17 種氨基酸進行分離測定，氨基酸濃度在0.025～0.350 μmol/mL時，其峰面積和氨基酸濃度的線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.988，重復(fù)性較好，牛乳加標(biāo)回收率范圍在94.2%～103.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.89%～3.31%。通過對比分 析 牛乳和大豆的氨基酸圖譜找到含量差異較大的6 種氨基酸，并根據(jù)模 擬摻假實驗樣品的氨 基酸分析6 種氨基酸含量和摻假量的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2達0.889，建立牛乳中大豆蛋白摻假的定性定量檢測方法。

氨基酸分析儀；牛乳；大豆分離蛋白；摻假檢測

隨著人民生活水平的日益提高，鮮牛乳的消費量迅速增加，飲用鮮牛乳、純牛乳已漸漸成為習(xí)慣[1]。在純牛乳中非法添加大豆蛋白以提高蛋白質(zhì)含量從而獲得較高的經(jīng)濟效益，不僅降低了牛乳的營養(yǎng)價值[2]，也嚴重損害了廣大消費 者的利益。因此，檢測原料乳中摻入大豆蛋白對原料乳的質(zhì)量控制有重要意義。目前的乳品蛋白質(zhì)摻假檢測方法涉及了色譜、質(zhì)譜、免疫、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、電泳、光譜學(xué)、分析化學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域[3]。王金敏等[4]利用傳統(tǒng)的化學(xué)檢測方法檢測牛乳中的大豆蛋白，簡單快速但只能定性不利于蛋白的定量檢測[5]。吳茹怡[6]通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中牛乳和大豆蛋白的條帶對比可檢測摻假量體積分數(shù)5%的豆?jié){，凝膠電泳耗時較長且檢出限較低。李亮[7]、Luykx[8]、Lopez-Calleja[9]等分別利用近紅外光譜法、高效液相色譜法以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等結(jié)合化學(xué)測定方法或質(zhì)譜法可以定性定量檢測牛乳中的大豆蛋白，但是檢測成本較高[10]。本實驗使用氨基酸分析儀，利用牛乳和大豆蛋白質(zhì)的氨基酸組成含量差異對牛乳中摻入的大豆蛋白進行定性定量檢測，彌補了現(xiàn)有方法耗時長檢測不靈敏的不足。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳（樣品編號1～5，每個樣品都為多頭奶牛的混合常乳，奶牛品種為荷斯坦乳牛） 沈陽輝山牧場。

大豆分離蛋白S1 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；大豆分離蛋白S2 西亞試劑公司；大豆分離蛋白S3古神生物科技集團有限公司；17 種氨基酸標(biāo)樣及正亮氨酸 美國Sigma公司；鹽酸（優(yōu)級純）；實驗室用水為超純水；氨基酸分析儀配套的流動相（緩沖液和茚三酮溶液）。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8800型氨基酸分析儀及數(shù)據(jù)處理平臺 日本日立公司；KQ-250B型超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；凱氏定氮裝置、高速冷凍離心機 上海盧湘儀器有限公司；均質(zhì)儀 美國Omin公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳樣品前處理

5 種鮮牛乳在4 ℃條件下，5 000 r/min離心30 min[11]，去除上層脂肪得到脫脂牛乳，編號為鮮牛乳1～5。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定

凱氏定氮法[12]分別測脫脂后的5 種鮮牛乳和3 種大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 模擬摻假實驗

取牛乳1分別添加10%、5%、2%、1%、0%的大豆分離蛋白S1（每個摻假樣品的蛋白質(zhì)含量保持一致），將以上樣品經(jīng)均質(zhì)儀反復(fù)均質(zhì)3 次，再經(jīng)渦輪攪拌過夜備用[13]。摻假牛乳2～5處理方法同摻假牛乳1。

1.3.4 樣品處理[14-17]

取2.5 mL液體樣品（0.100 g固體樣品）于水解管中加10 mL 6 mol/L鹽酸滴入正辛醇充氮后封管置于110 ℃烘箱中保持24 h，冷卻后經(jīng)濾紙過濾到50 mL容量瓶中用超純水反復(fù)沖洗水解管及濾紙最后定容。取 1 mL的樣液于蒸發(fā)皿中在蒸氣浴上蒸干，然后加0.02 mol/L鹽酸2.5 mL溶解用針管過濾器過濾，備用上機。

1.3.5 色譜條件[18-22]

熒光激發(fā)波長338 nm；熒光發(fā)射波長425 nm；柱溫62 ℃；反應(yīng)器35 ℃；進樣量10 μL；流速0.4 mL/min；柱后泵流速0.4 mL/min；流動相配制見表1，梯度洗脫程序見表2。

表1 流動相的配制Table 1 Preparation of mobile phase

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elut ion program

1.3.6 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液配制成濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.150、0.200、0.250、0.300、0.350 μmol/mL的溶液，利用正亮氨酸內(nèi)標(biāo)法[23]，以每一種氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)正亮氨酸峰面積之比為縱坐標(biāo)，氨基酸標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，每一種標(biāo)準(zhǔn)液都按1.3.5節(jié)色譜條件進行上機測定。

1.3.7 方法精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性實驗

取標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，經(jīng)處理后連續(xù)進樣6 次以及分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，以色譜峰峰面積為指標(biāo)計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），考察精密度及穩(wěn)定性。取同一種牛乳6 份，處理后進樣，以同樣方法計算 RSD，考察方法的重復(fù)性。

1.3.8 加標(biāo)回收率實驗

精密稱取適量牛乳，按1.3.4節(jié)方法處理樣品，分別加入一定量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行上機分析平行6 次，進行加標(biāo)回收率的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

通過凱氏定氮法測得的樣品蛋白質(zhì)含量見表3。

表3 樣品蛋白質(zhì)含量Table 3 Protein content of milk and soybean protein isolate g/100 g

2.2 氨基酸標(biāo)樣的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

圖1 17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 17 amino acid standards

17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。按照1.3.6節(jié)方法得到各氨基酸的工作曲線和回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2及線性范圍見表4，氨基酸濃度在0.025～0.350 μmol/mL時，其峰面積和氨基酸濃度的線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.988，相關(guān)性較好。

表4 17 種氨基酸的線性回歸方程Table 4 Linear regression equations of 17 amino acids

2.3 方法精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性實驗

17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度實驗，RSD在0.89%～2.11%（n=6）；穩(wěn)定性實驗RSD在 0.67%～2.07%（n=6），均在允許范圍內(nèi)。17 種氨基酸的峰面積的RSD在1.20%～2.58%。說明此方法精密度高，重復(fù)性好且穩(wěn)定，可應(yīng)用于樣品中17 種氨基酸的分析。

2.4 加標(biāo)回收率實驗

表5 17 種氨基酸的回收率（n=6）Table 5 Mean recoveries for 17 amino acids (n= 6) %

表5表明牛乳中氨基酸的平均 回收率在94.2%～103.1%，RSD在0.89%～3.31%均在允許范圍內(nèi)，結(jié)果較好。

2.5 氨基酸圖譜對比

圖2 牛乳1水解液氨基酸的色譜圖Fig.2 Chromatograms of amino acids in the milk1

圖3 大豆分離蛋白S1水解液氨基酸的色譜圖Fig.3 Chromatograms of amino acids in the soybean protein isolated 1

表6 大豆蛋白和牛乳水解后的氨基酸平均值Table 6 Average amino acid contents of hydrolyzed milk and soybean protein

實驗對5 個牛乳樣品和3 種購于不同廠家的大豆分離蛋白進行了氨基酸測定，對比氨基酸的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)不同樣品牛乳各峰的保留時間、面積基本一致，不同大豆分離蛋白的氨基酸圖譜基本相似。說明這一牧場的牛乳水解的各種氨基酸含量組成基本接近，不同種大豆分離蛋白的氨基酸含量組成相差不大。牛乳1的氨基酸圖譜見圖2，大豆分離蛋白S1圖譜見圖3。通過對大豆分離蛋白和牛乳氨基酸圖譜中各個峰的面積及保留時間的比較和表6中對大豆分離蛋白和牛乳水解后的氨基酸含量的比較綜合發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白水解后的天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸明顯高于牛乳，賴氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、半胱氨酸則是牛乳水解液中較多，蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸等在牛乳和大豆分離蛋白中相差不大。

2.6 檢測牛乳中摻入大豆蛋白的方法的建立

2.6.1 摻假牛乳中6 種氨基酸含量與大豆蛋白添加量的關(guān)系

根據(jù)2.5節(jié)的結(jié)論可以假設(shè)隨著大豆分離蛋白在牛乳中添加量的增加，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸在牛乳中的含量也隨之增加。由圖4可知，6 種氨基酸含量與大豆蛋白添加 量都存在著一定的線性關(guān)系。

圖4 摻假牛乳1中6 種氨基酸含量與大豆蛋白添加量的線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship between the individual contents of 6 amino acids in adulterated milk 1 and the amounts of added soybean protein isolate

表7 摻假牛乳1中6 種氨基酸含量與大豆蛋白添加量的線性方程Table 7 The linear equation between the contents of 6 amino acids in the adulterated milk 1 and the appending proportion of soybean protein isolated

2.6.2 摻假牛乳中6 種氨基酸含量和與大豆蛋白添加量的關(guān)系

對牛乳1的每種摻假水平下的6 種氨基酸含量和與大豆蛋白的添加量作圖見圖5，得到氨基酸含量和與大豆分離蛋白添加量的線性方程y=0.062x+6.625 其中R2=0.944，相關(guān)性較好。按照此方法，對牛乳2～5中的6 種氨基酸含量和與大豆蛋白的添加量作圖見圖6，可以看出每一種牛乳的氨基酸含量和與大豆分離蛋白的添加量都具有線性關(guān)系，牛乳4的相關(guān)性最好R2=0.975，而牛乳2的相關(guān)最低但也達到了0.845，牛乳3和牛乳5的相關(guān)系數(shù)也都在0.900以上。

圖5 摻假牛乳1中6 種氨基酸含量和與大豆蛋白添加量的線性關(guān)系Fig.5 Linear relationship between the total content of 6 amino acidsin adulterated milk 1 and the amounts of soybean protein isolate

2.6.3 線性關(guān)系的確定

由2.6.2節(jié)可知，每種摻假牛乳的摻假量都可以通過特定的6 種氨基酸含量和進行檢測。而由2.5節(jié)可知，輝山牧場不同的牛乳氨基酸的組成比例也基本相同，那么若將這5 種牛乳綜合起來得到的線性關(guān)系則更具代表性，以牛乳中大豆分離蛋白添加量與5 種牛乳的6 種氨基酸含量線性關(guān)系見圖7。5 種牛乳綜合后的氨基酸含量與大豆分離蛋白的添加量呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.061x+ 6.586，R2=0.889，相關(guān)性較好。

圖7 摻假牛乳中6 種氨基酸含量和與大豆蛋白添加量的線性關(guān)系Fig.7 Linear relationships between the total content of 6 amino acids in adulterated milk and the amounts of added soybean protein isolate

3 結(jié) 論

利用氨基酸分析儀對牛乳、大豆、摻假樣品中17 種氨基酸進行分析，方法簡單，準(zhǔn)確度、重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。取自同牧場同品種乳牛的常乳樣品氨基酸圖譜相似，氨基酸組成和比例基本一致；不同廠家的大豆分離蛋白的氨基酸圖譜及含量差別不大，說明實驗具有一定的區(qū)域代表性。不同的牛乳樣品通過模擬摻假實驗，以摻假樣品中的6 種氨基酸（天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸）含量為橫坐標(biāo)以摻假的大豆分離蛋白占樣品總蛋白的百分比為縱坐標(biāo)得到線性方程y=0.061x+6.586，R2=0.889重復(fù)性較好，即可通過樣品中特定氨基酸含量和推算出摻入大豆蛋白的比例，從而建立了純牛乳中大豆蛋白摻假的定量檢測方法，且大豆蛋白摻假量在總蛋白含量的1%以上時，此法就可有效地進行檢測，方法簡單，靈敏度高。本研究為牛乳中大豆蛋白的摻假檢測提供了創(chuàng)新方法，對更廣闊區(qū)域內(nèi)的牛乳和其他類蛋白質(zhì)摻假還有待進一步的驗證和探索。

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Detection of Soybean Protein in Adulterated Milk by Amino Acid Analyzer

YU Fang-yuan, YUE Xi-qing*, WU Jun-rui, TIAN Y e
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The separation and analysis of 17 amino acids in milk protein and soybean protein were conducted by amino acid analyzer. When the concentrations of amino acids were in the range of 0.025–0.350 μmol/mL, the correlation coefficients between peak areas and amino acid co ncentrations were above 0.988, th e calibration curves of 17 amino acids all exhibited good linearit y and repeatability. Mean recovery rates and relative standard derivations (RSDs) for 17 amino acids from spiked samples were in the ranges of 94.2% to 103.1%, and 0.89% to 3.31%, respectively. The linear relationship between the contents of 6 selected amino acids showing significant differences in the amino acid profiles of the two proteins and the amounts of added soybean protein was established by adulteration simulation experiments with correlation coefficients above 0.889. This study has provided a good method for qualitative and quantitative detection of soybean protein adulterated milk.

amino acid analyzer; adulterated milk; soybean protein isolated; detection

TS207.3

A

1002-6630（2014）22-0238-05

10.7506/spkx1002-6630-201422046

2013-11-06

于方園（1988—），女，碩士研究生，研究方向為動物性食品科學(xué)利用技術(shù)。E-mail：410601479@qq.com

*通信作者：岳喜慶（1966—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：yxqsyau@126.com