邵碧英，陳 彬，陳文炳，楊 方，繆婷玉，彭 娟

（福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，福建省檢驗檢疫技術(shù)研究重點實驗室，福建 福州 350001）

河豚毒素DNA適配子的制備及應(yīng)用

邵碧英，陳 彬，陳文炳，楊 方，繆婷玉，彭 娟

（福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，福建省檢驗檢疫技術(shù)研究重點實驗室，福建 福州 350001）

人工合成78個堿基的隨機ssDNA文庫，采用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)與誘變聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）結(jié)合的方法，通過篩選富集、克隆、測序，獲得了與河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）特異結(jié)合的單克隆DNA適配子A3。DNA適配子A3的二級結(jié)構(gòu)主要為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與TTX的親和力為1.254。對適配子和TTX結(jié)合的磷酸鹽緩沖液pH值、熒光染料結(jié)合時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，最適pH值為7.5，最佳結(jié)合時間為10 min。建立的快速篩選檢測TTX的DNA適配子-熒光染料法對TTX的檢出限為10－6mo1/L。

河豚毒素；適配子；熒光染料；檢測

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一種毒性很強的小分子物質(zhì)。TTX的檢測方法有生物法[1]、熒光光度法[2]、酶免疫分析法[3]、色譜法[4]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]、液相色譜-熒光檢測法[7-8]等。鼠生物法是測定TTX的傳統(tǒng)方法，但該法與小鼠個體差異顯著相關(guān)，且操作復(fù)雜。用酶免疫分析法測定TTX，需要制備TTX的抗體，而TTX是小分子物質(zhì)，其抗體尤其是單克隆抗體很難制備。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等雖然特異性強、靈敏度高，但都需要昂貴的儀器。適配子（又稱適體）是通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)從人工合成的DNA或RNA隨機文庫中篩選出來的，與非核酸靶物質(zhì)特異結(jié)合的高親和性單鏈寡核苷酸序列。目前已有包括病毒[9]、細(xì)菌[10-11]、蛋白質(zhì)[12-13]、染料[14]、抗生素[15-16]、農(nóng)藥[17-19]、生物毒素[20-21]、重金屬[22]等多種靶物質(zhì)適配子篩選及應(yīng)用的研究報道。本實驗在先前研究[23]的基礎(chǔ)上，以TTX為靶物質(zhì)，采用SELEX技術(shù)與誘變聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相結(jié)合的方法，從中間為35 個堿基的隨機序列、全長為78個堿基的ssDNA文庫中篩選、獲得了能特異結(jié)合TTX的DNA適配子，并以該適配子為探針初步建立了TTX的DNA適配子-熒光染料檢測法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TTX（純度≥99%） 成都曼思特生物科技有限公司；隨機ssDNA文庫、引物，參照文獻(xiàn)[23]，將隨機部分改為35 個堿基，總長為78 個堿基，委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，隨機ssDNA文庫用TE溶液（pH 8.0）稀釋至濃度為40 μmol/L，引物稀釋至10 μmol/L，－20 ℃保存?zhèn)溆?；熒光染料EvaGreenTM（使用時按1∶20比例進(jìn)行稀釋；0.01mol/L磷酸鹽（phosphatebuffered saline，PBS）緩沖液（pH 6.0～8.0）） 美國Biotium公司；其他材料與試劑參照文獻(xiàn)[23]。

1.2 儀器與設(shè)備

Uitrospec 1100pro型核酸/蛋白分析儀 英國安瑪西亞公司；Tgradient型梯度PCR儀 德國Biometra公司；Infinite F200 Pro增強型熒光化學(xué)發(fā)光微孔板讀數(shù)儀瑞士Te can公司。

1.3 方法

1.3.1 TTX DNA適配子的制備

參照文獻(xiàn)[23]，采用SELEX技術(shù)、結(jié)合誘變PCR技術(shù)，通過克隆、測序、親和力測定等手段，制備與TTX特異結(jié)合的單克隆DNA適配子，用DNAMAN軟件分析DNA適配子的核苷酸序列和二級空間結(jié)構(gòu)，并測定適配子與TTX的親和力。

1.3.2 TTX DNA適配子-熒光染料檢測法的建立

1.3.2.1 檢測原理

熒光染料EvaGreenTM本身沒有熒光，與dsDNA作用時，EvaGreenTM嵌合到dsDNA中，產(chǎn)生較強的熒光信號。當(dāng)dsDNA與TTX孵育后，TTX能識別與其特異性結(jié)合的適配子，并形成適配子-TTX復(fù)合物，使dsDNA的雙鏈解開，dsDNA變成ssDNA，嵌合的熒光染料EvaGreenTM從dsDNA中得以釋放，從而導(dǎo)致系統(tǒng)熒光信號驟然減弱，通過檢測系統(tǒng)中熒光信號的變化就可篩選檢測TTX[24]。

1.3.2.2 DNA適配子的dsDNA的制備

以1.3.1節(jié)獲得的單克隆DNA適配子為模板，參照文獻(xiàn)[23]，用引物Ⅰ、引物Ⅱ進(jìn)行PCR擴增，純化PCR產(chǎn)物，即得到dsDNA，于核酸/蛋白分析儀上測定濃度，用ddH2O將dsDNA稀釋至10 pmol/L，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 檢測步驟

取DNA適配子的dsDNA，加入適宜pH值的0.01 mol/L磷酸緩沖液，再加入TTX待測樣品，室溫條件下孵育l h。孵育結(jié)束后，加入2 ?L熒光染料EvaGreenTM，結(jié)合一段時間后，測定熒光強度值，根據(jù)熒光變化值判定結(jié)果，熒光變化值大的表明TTX含量高。

1.3.2.4 PBS緩沖液pH值的優(yōu)化

分別取5 ?L稀釋好的dsDNA于5 個編號為1～5的l.5 mL 離心管中，各管中分別加入589 ?L pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的PBS緩沖液（0.01 mol/L）和6 ?L TTX溶液（1 mmol/L），混勻，置室溫孵育l h；取198 ?L TTX與dsDNA反應(yīng)后的混合液于酶聯(lián)微孔中，每個pH值重復(fù)3 孔，每孔中加入2 ?L熒光染料EvaGreenTM，結(jié)合10 min；用熒光化學(xué)發(fā)光微孔板讀數(shù)儀測定熒光強度值，設(shè)置儀器激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為533 nm，取重復(fù)3 孔的平均值。

1.3.2.5 熒光染料結(jié)合時間的優(yōu)化

取5 ?L稀釋好的dsDNA，加589 ?L 1.3.2.4節(jié)優(yōu)化選定的PBS緩沖液和6 ?L TTX溶液（1 mmol/L），混勻，置室溫孵育l h；取198 ?L TTX與dsDNA反應(yīng)后的混合液，加入2 ?L熒光染料EvaGreenTM，結(jié)合一定時間后，測定熒光強度值，取重復(fù)3 孔的平均值。

1.3.2.6 DNA適配子-熒光染料檢測法對TTX檢出限的測定

用1%乙酸溶液將TTX溶液按照1∶10進(jìn)行系列稀釋，濃度為10－1～10－7mol/L；分別取5 ?L 10 pmol/L dsDNA于8 個編號為1～8的l.5 mL 離心管中；每管加589 ?L優(yōu)化選定的PBS緩沖液，1號管中加入6 ?L PBS緩沖液作為空白對照，2～8號管中分別加入6 ?L 系列稀釋的TTX溶液，混勻，置室溫孵育l h；取198 ?L TTX與dsDNA反應(yīng)后的混合液，同時取200 ?L PBS緩沖液作為背景信號，分別加入2 ?L熒光染料EvaGreenTM，結(jié)合時間為1.3.2.5節(jié)優(yōu)化后的時間，測定熒光強度值，取重復(fù)3 孔的平均值。1.3.3 DNA適配子-熒光染料檢測法的實際應(yīng)用

TTX主要存在于河鲀的性腺、肝臟、脾臟、腎臟、眼睛、皮膚、血液等部位，肉多為弱毒或無毒，因此選取魚的內(nèi)臟進(jìn)行TTX測定的實驗。收集非洲鯽魚、草魚作為陰性對照。兔頭鲀、橫紋東方鲀、月腹刺鲀、紅鰭東方鲀等河豚魚樣品由本實驗收集保存[25]。分別取實驗材料的內(nèi)臟，勻漿，稱取5.00 g勻漿試樣，參照文獻(xiàn)[7]提取、凈化TTX，用建立的DNA適配子-熒光染料法檢測是否含有TTX。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTX DNA適配子的制備及分析結(jié)果

圖1 預(yù)測的DNA適配子A3的二級結(jié)構(gòu)Fig.1 Predicted secondary structure of the DNA aptamer

將SELEX技術(shù)與誘變PCR技術(shù)相結(jié)合，從隨機ssDNA中篩選到能與TTX特異結(jié)合、親和力最高的1 條單克隆DNA適配子（標(biāo)記為A3），核苷酸序列為：5’-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AAC CCT GCC GGG GGC TTC TCC TTG CTG CTC TGC TCT GTT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3’。用DNAMAN軟件分析，DNA適配子A3的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖1所示，主要為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。DNA適配子A3與TTX的親和力為1.254。

2.2 PBS緩沖液pH值的優(yōu)化結(jié)果

圖2 PBS緩沖液pH值的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Selection of optimal PBS buffer solution pH

如圖2所示，不同pH值的PBS緩沖液對熒光強度的檢測具有顯著的影響，當(dāng)pH值為7.5時，熒光強度值最小，即熒光變化值最大，說明在pH 7.5時，緩沖液對反應(yīng)體系的影響最小。這是因為熒光強度的變化由EvaGreenTM的釋放量決定，EvaGreenTM的釋放量又受適配子-TTX結(jié)合程度的影響，而pH值能夠影響適體-TTX復(fù)合物的解離。在pH 7.5時，適體-TTX復(fù)合物的解離程度最小，因此pH 7.5是本反應(yīng)體系的最適pH值。

2.3 熒光染料結(jié)合時間的優(yōu)化結(jié)果

圖3 熒光染料結(jié)合時間的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Selection of optimal fluorochrome-binding time

如圖3所示，在加入染料后，前10 min內(nèi)熒光強度呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，在10 min時達(dá)到最大值，之后熒光強度值逐漸下降，至30 min后趨于穩(wěn)定。熒光染料與DNA適配子的dsDNA的結(jié)合處于一個動態(tài)的變化過程，在不斷的結(jié)合同時又不斷的解離，需要反應(yīng)一段時間才能達(dá)到平衡，而染料與DNA適配子的dsDNA結(jié)合后也會出現(xiàn)緩慢淬滅，所以在達(dá)到最大熒光強度后又開始逐漸減弱。只有當(dāng)熒光染料與適配子處于結(jié)合的最佳狀態(tài)時，體系才會產(chǎn)生最大熒光。由圖3可知，結(jié)合時間為10 min時，熒光強度最大，由此表明熒光染料EvaGreenTM與DNA適配子dsDNA的最佳結(jié)合時間為10 min。

2.4 DNA適配子-熒光染料法對TTX檢出限的測定結(jié)果

空白對照的熒光強度為324.5，背景信號為9.57，DNA適配子-熒光染料法對TTX檢出限的測定結(jié)果如圖4所示。隨著TTX濃度的減小，所測得的熒光強度與空白對照的變化值越來越小，當(dāng)TTX濃度為10－7mo1/L時，熒光強度和空白對照很相近，變化值接近于背景信號值，表明此法對濃度為10－7mo1/L TTX的檢測已無意義。因此，建立的檢測方法可檢測低至10－6mo1/L的TTX。

圖4 方法檢出限的測定結(jié)果Fig.4 Detection limit of the developed method

TTX的分子式為C11H17N3O8，相對分子質(zhì)量為319.271，當(dāng)TTX濃度為10－6mo1/L時，換算成質(zhì)量濃度時約為3.19×10－4mg/mL。而現(xiàn)行采用的用于測定TTX的GB/T 23217—2008《水產(chǎn)品中TTX的測定：液相色譜-熒光檢測法》中對TTX標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限為5×10－2mg/mL[23]。由此可見，本實驗建立的TTXDNA適配子-熒光染料法的檢出限低于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)能滿足日常檢測的需求。

2.5 TTX DNA適配子-熒光染料法的實際應(yīng)用

用建立的DNA適配子-熒光染料法測定了非洲鯽魚、草魚和4 種河豚魚的內(nèi)臟提取液的TTX，結(jié)果如表1所示，非洲鯽魚、草魚的熒光差值極小，而4 種河豚魚的熒光差值都較大，且大于背景信號，表明4 種河豚魚的TTX的檢測結(jié)果均為陽性，也表明建立的檢測方法特異性好。

表1 魚樣品中TTTTXX的檢測結(jié)果（n=3）Table 1 Detection of TTX in fish samples (n = 3)

3 討 論

熒光染料EvaGreenTM在適配子的應(yīng)用研究中已得到較廣泛應(yīng)用[24,26]。本實驗應(yīng)用SELEX技術(shù)與誘變PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，制備了能特異結(jié)合TTX的全長為78個堿基的DNA適配子，并根據(jù)DNA適配子-TTX復(fù)合物與熒光染料EvaGreenTM的作用，建立了TTX的DNA適配子-熒光染料檢測方法。該方法與現(xiàn)有的TTX檢測方法相比，無需昂貴的儀器和復(fù)雜的操作，具有操作簡便、成本低廉、快速、靈敏等優(yōu)點，但此方法在TTX檢測上的精確應(yīng)用，包括熒光強度變化值與TTX濃度的線性關(guān)系、回收率、精密度和重復(fù)性等還需進(jìn)一步研究。

有文獻(xiàn)報道，經(jīng)過實驗篩選獲得的適配子在實際應(yīng)用中起主要作用的只是其中的一小部分核苷酸，即所謂的核心區(qū)域[27]。一旦分析獲得此核心區(qū)域，剔除了不需要的核苷酸部分，減少了非核心區(qū)域的干擾作用，與靶物質(zhì)的結(jié)合效果更好。在先前的研究中，邵碧英等[23]成功地從總長為113 個堿基的隨機ssDNA文庫中篩選到與TTX最高親和力的DNA適配子G10。為了獲得堿基數(shù)更少的DNA適配子，從而降低下一步識別適配子核心區(qū)域的難度，又從總長為78 個堿基的隨機ssDNA文庫中篩選到了與TTX有最高親和力并有實際應(yīng)用效果的DNA適配子A3。適配子A3、G10均包括了兩端固定序列以及從隨機序列中篩選到的特定序列，其核心區(qū)域具體是哪部分核苷酸、以及核心區(qū)域的應(yīng)用效果如何尚待研究。

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Preparation and Application of Tetrodotoxin DNA Aptamer

SHAO Bi-ying, CHEN Bin, CHEN Wen-bing, YANG Fang, MIAO Ting-yu, PENG Juan
(Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Center of Inspection and Quarantine Technology, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)

A 78-mer ssDNA library was synthesized in vitro. The tetrodotoxin (TTX) specifi c monoclonal DNA aptamer A3 was prepared using systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) combined with mutagenic PCR by screening, enrichment, cloning and sequencing. The secondary structure of the DNA aptamer A3 mainly contained stem ring structure, and the affi nity for tetrodotoxin was 1.254. The PBS buffer pH and fl uorochrome-binding time were optimized. The results showed that the optimum pH was 7.5 and the best binding time was 10 min. As a result, a DNA aptamerfl uorochrome method for rapidly screening and detecting tetrodotoxin was developed with a detection limit of 10-6mo1/L.

tetrodotoxin; aptamer; fluorochrome; detection

Q78

A

1002-6630（2014）24-0205-04

10.7506/spkx1002-6630-201424039

2014-06-30

國家質(zhì)檢總局科研項目（2010IK145；2014IK104）

邵碧英（1973—），女，研究員，博士，研究方向為食品生物學(xué)分子檢測。E-mail：byshao@sohu.com