郝淑賢，林婉玲，李來好，楊賢慶，周婉君，黃 卉，魏 涯，岑劍偉，葉 鴿

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300）

不同提取方法對(duì)羅非魚皮膠原蛋白理化特性的影響

郝淑賢，林婉玲，李來好，楊賢慶，周婉君，黃 卉，魏 涯，岑劍偉，葉 鴿

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300）

以羅非魚皮為研究對(duì)象，分析熱水法提取、酸法提取及超聲波輔助酶法提取對(duì)魚皮膠原蛋白理化特性的影響。結(jié)果表明：3種提取方法所得膠原蛋白紫外光譜吸收特性峰在220～232 nm之間；提取方法對(duì)羥脯氨酸和脯氨酸含量影響差異不顯著，但熱水提取可顯著提高魚皮膠原蛋白的凝膠強(qiáng)度，酸法提取可顯著提高魚皮膠原蛋白的特性黏度；3種魚皮膠原蛋白的變性溫度都在31 ℃附近，提取方法對(duì)變性溫度影響差異不顯著；熱水法提取膠原蛋白的等電點(diǎn)（pI 5.9）低于其他方法所得膠原蛋白（pI 7附近）。

羅非魚皮；膠原蛋白；提??；理化特性

羅非魚是中國重要的養(yǎng)殖魚類，具有繁殖能力強(qiáng)、生長速度快、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來隨著國際市場需求量的日益增加，中國羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加[1]。在中國，只有少部分羅非魚用于鮮食，絕大部分被加工成凍魚片出口銷售，加工中產(chǎn)生的魚頭、魚骨、魚皮及碎肉等加工副產(chǎn)物約占魚體總質(zhì)量的40%～65%，這些原料通常得不到合理的加工利用，或被丟棄、掩埋，或被加工成魚骨粉作為飼料廉價(jià)出售，不僅導(dǎo)致寶貴資源的大量浪費(fèi)，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染[2]。因此，如何有效地利用這部分資源，已成為羅非魚產(chǎn)業(yè)面臨的關(guān)鍵問題。

羅非魚皮是開發(fā)膠原蛋白的重要資源。2010年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，中國羅非魚年產(chǎn)量約為1.2×106t，其中用于加工的羅非魚約為6×105t[3]，按魚皮占活體質(zhì)量的4%計(jì)，每年約有2.4×104t羅非魚皮可以被利用。目前，關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物中膠原蛋白的提取方法的研究報(bào)道較多，其中包括熱水浸提、酸法浸提、堿法浸提、鹽法浸提與酶法浸提等[4-5]。這些方法基本都是通過改變蛋白質(zhì)所在的外界環(huán)境，把膠原蛋白從其他蛋白質(zhì)中分離出來。由于提取方法對(duì)所提取的膠原蛋白理化特性存在不同程度的影響，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)針對(duì)熱水浸提、酸法浸提、超聲輔助酶法提取等方法對(duì)羅非魚皮膠原蛋白理化特性的影響進(jìn)行分析，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮由廣東省鷺業(yè)水產(chǎn)有限公司提供，魚皮用0～4 ℃冰水清洗后，去除脂肪等雜物，切成小塊（1 cm×1 cm）于-18 ℃貯藏備用。

鹽酸、乳酸、檸檬酸等化學(xué)試劑均為分析純 廣州化學(xué)試劑廠；酪蛋白、R-250考馬斯亮藍(lán) 上海普欣生物技術(shù)公司；甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris-HCl、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、中高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、30%凝膠貯液美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Genesystem5紫外-可見分光光度計(jì) 美國Thermo Spectronic公司；QTS-25型質(zhì)構(gòu)儀 英國CNS Farnell公司；烏式黏度計(jì) 上海申立儀器公司；ALPHA1-4冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；PHS-2F數(shù)字pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；Akkv-drive電子滴定儀 德國赫施曼公司；PowerPac Basic電泳儀 美國Bio-Rad公司；Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白提取

1.3.1.1 熱水法提取

參考楊賢慶等[6]的方法，略有改動(dòng)。將魚皮用20 倍體積（m/V）的0.2 mol/L鹽酸于4 ℃浸泡處理后20 min，料液比1∶20（m/V），浸泡后取出魚皮用蒸餾水洗滌至pH 5，瀝水后用7 倍體積(m/V)的蒸餾水浸泡，于42 ℃水浴提取12.5 h，4 ℃、10 000 r/min冷凍離心20 min后，上層溶液經(jīng)冷凍干燥后即得羅非魚皮膠原蛋白成品。

1.3.1.2 酸法提取

參考傅燕鳳等[7]的方法，略有改動(dòng)。將魚皮用10倍體積（m/V）的3%NaCl于4 ℃條件下浸泡6 h，用0.1 mol/L檸檬酸浸泡提取48 h，4 ℃、10 000 r/min冷凍離心20 min后，取上層黏稠液用0.9 mol/L NaCl沉淀2 h后，4 ℃、10 000 r/min冷凍離心20 min后，沉淀用蒸餾水復(fù)溶后于4 ℃透析，直至硝酸銀檢驗(yàn)無白色沉淀。透析液置于-18 ℃冰箱中冷凍過夜，冷干后即得膠原蛋白成品。

1.3.1.3 超聲輔助酶法提取

參考楊萌萌等[8]的方法，略有改動(dòng)。魚皮加入15倍體積0.1 mol/L檸檬酸，3%胃蛋白酶，于10 ℃條件下用90 W超聲波進(jìn)行輔助提取6.5 h，95 ℃滅酶5 min后，4 ℃、10 000 r/min冷凍離心20 min，上層溶液經(jīng)冷凍干燥即得羅非魚皮膠原蛋白成品。

1.3.2 紫外光譜掃描

參考Caputo等[9]的方法略有改進(jìn)。將不同提取方法所得膠原蛋白配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL溶液（溶劑為0.5 mol/L醋酸），應(yīng)用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)膠原蛋白溶液進(jìn)行掃描，掃描范圍為200～400 nm，掃描速率為600 nm/min。

1.3.3 氨基酸組成

參考Su Xiurong等[10]的方法，略有改動(dòng)。將膠原蛋白樣品置于水解管中，加入6 mol/L鹽酸，真空密封，于130 ℃水解40 min。水解液用4 mol/L和0.1 mol/L的NaOH中和，過濾后，準(zhǔn)確吸取濾液2 mL，過0.25 μm膜后用氨基酸自動(dòng)分析儀測定樣品氨基酸含量。

1.3.4 凝膠強(qiáng)度測定

參考Hao Shuxian等[11]的方法，稱取膠原蛋白樣品用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為6.67 g/100 mL的溶液，充分溶解后，取10 mL溶液置于小燒杯，5 ℃冰箱冷卻過夜后，用質(zhì)構(gòu)儀測定樣品凝膠強(qiáng)度，壓頭為圓柱形，直徑12.5 mm，壓速30 mm/min，行進(jìn)距離10 mm。

1.3.5 特性黏度的測定

參考楊賢慶等[6]的方法，將膠原蛋白樣品用醋酸溶解，以0.5 mol/L的醋酸為對(duì)照，于25 ℃條件下分別測定膠原蛋白質(zhì)量濃度為1.00、0.83、0.67、0.50、0.33 mg/mL時(shí)的黏度，計(jì)算公式為：

式中：t為樣品流出時(shí)間；t0為醋酸流出時(shí)間；ρ為膠原蛋白樣品質(zhì)量濃度；ηsp/ρ為比濃度黏度；[η]為質(zhì)量濃度外推到0時(shí)的比濃黏度即特性黏度。

1.3.6 變性溫度測定

參考鐘朝輝等[12]的方法，將膠原蛋白樣品用醋酸溶解成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，分別測定樣品在15～45 ℃范圍內(nèi)的增比黏度，各溫度點(diǎn)恒溫30 min，不同溫度下的流出時(shí)間，以0.5 mol/L為對(duì)照。

1.3.7 等電點(diǎn)測定

將幾種膠原蛋白用雙蒸水配成5 mg/mL溶液，用0.01 mol/L鹽酸和0.01 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值，同時(shí)用電導(dǎo)儀測定樣品在不同pH值下的電導(dǎo)率，根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)電導(dǎo)率最低的原理確定溶液的等電點(diǎn)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚皮膠原蛋白的紫外光譜分析

C=O、COOH和CONH2基團(tuán)是膠原蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)中典型的生色基團(tuán)，這些基團(tuán)存在很強(qiáng)的紫外吸收特性，是判斷膠原蛋白類型的重要標(biāo)志。由圖1可知，熱水提取膠原蛋白、酸法提取膠原蛋白和超聲波輔助酶法提取膠原蛋白的最大吸收峰分別為232、222、223 nm，與Ⅰ型膠原蛋白特征吸收峰一致。陳善飛等[14]研究發(fā)現(xiàn)鰱魚皮膠原蛋白紫外最大吸收峰為231 nm，與本實(shí)驗(yàn)中的水溶性膠原蛋白紫外吸收特性相似，但陳善飛等認(rèn)為不同提取方法對(duì)鰱魚皮膠原蛋白的紫外吸收特性影響無差異。張建忠等[15]研究表明草魚皮酸溶性膠原蛋白的最大吸收峰在222 nm，酶溶性膠原蛋白的最大吸收峰在223 nm波長處，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。

圖1 羅非魚皮膠原蛋白的紫外光譜分析Fig.1 UV spectra of collagens from tilapia skin

2.2 羅非魚皮膠原蛋白的凝膠強(qiáng)度和特性黏度

表1 羅非魚皮膠原蛋白凝膠強(qiáng)度和特性黏度Table 1 Gel strength and intrinsic viscosity of collagens from tilapia skin

由表1可知，熱水法提取膠原蛋白溶液凝膠強(qiáng)度最高，約為682 g，較其他兩種方法高出1倍多。導(dǎo)致其他兩種處理所得膠原蛋白凝膠強(qiáng)度小于熱水提取的原因在于熱處理時(shí)間不同，使膠原蛋白形成凝膠過程膠原蛋白的變性程度產(chǎn)生差異。熱水法提取膠原蛋白是在42 ℃條件下熱水提取12.5 h，而其他兩種膠原蛋白只是42 ℃熱水處理30 min。溫度除影響凝膠強(qiáng)度外，還會(huì)影響膠原蛋白的特性黏度，這是由于膠原蛋白是由多種氨基酸以肽鍵相連，熱處理過程中，側(cè)鏈間的氫鍵和離子鍵被破壞，多聚體變成低聚體，分子間距增大，分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，使蛋白次級(jí)鍵斷裂的同時(shí)主鏈也會(huì)有少部分?jǐn)嗔眩L時(shí)間的熱處理，會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白黏度下降。研究結(jié)果表明熱水法提取的膠原蛋白特性黏度最低，而酸法提取的膠原蛋白特性黏度最高，這與Motero等[16]的研究結(jié)果相似。

2.3 羅非魚皮膠原蛋白的氨基酸組成

由表2可知，所得幾種膠原蛋白氨基酸組成沒有明顯的差別，羥脯氨酸和脯氨酸是膠原蛋白的典型氨基酸，羥脯氨酸含量最高的是超聲波輔助酶法提取膠原蛋白，最低的是熱水法提取膠原蛋白。不同提取方法對(duì)脯氨酸和羥脯氨酸含量的影響差異不顯著，3種不同提取方法所得膠原蛋白溶液兩種氨基酸含量基本相當(dāng)，處于17.64%～18.34%之間，Liu Haiying等[17]提取鯰魚皮膠原蛋白中羥脯氨酸和脯氨酸含量約為17%。各膠原蛋白的甘氨酸含量高，而酪氨酸和苯丙氨酸的含量均很低，符合膠原蛋白氨基酸組成的甘氨酸的含量和胱氨酸及羥脯氨酸等亞氨基酸含量高，而芳香族氨基酸和含硫氨基酸含量少的特征。

表2 羅非魚皮膠原蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of collagens from tilapia skin %

2.4 羅非魚皮膠原蛋白的變性溫度

膠原蛋白的熱穩(wěn)定性可以用膠原蛋白在溶液中分子的熱變性溫度（Td）表示，即膠原蛋白黏度變化一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度。幾種膠原蛋白的熱變性溫度曲線如圖2所示。

圖2 膠原蛋白熱變性溫度Fig.2 Thermal denaturation temperature curves of collagens from tilapia skin

由圖2可知，熱水法提取膠原蛋白、酸法提取膠原蛋白、超聲波輔助酶法提取膠原蛋白的熱變性溫度相近，都在31 ℃附近。Kimura等[18]認(rèn)為水產(chǎn)動(dòng)物膠原蛋白的熱變性溫度與其生存的最高環(huán)境溫度相似，而不受種屬影響。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，羅非魚皮膠原蛋白的熱變性溫度基本接近羅非魚生活環(huán)境溫度。

2.5 羅非魚皮膠原蛋白的等電點(diǎn)

等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)極性基團(tuán)解離的正負(fù)離子數(shù)相等，靜電荷為零時(shí)溶液的pH值。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)，而與環(huán)境pH值無關(guān)。等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)的一個(gè)重要參數(shù)，與蛋白質(zhì)側(cè)鏈酸性和堿性氨基酸的殘基比例相關(guān)。膠原蛋白在不同pH值條件下的電導(dǎo)率見圖3。

圖3 不同pH值條件下提取膠原蛋白的電導(dǎo)率Fig.3 Electrical conductivity of collagens from tilapia skin at different pH conditions

由圖3可知，不同膠原蛋白提取方法得到的膠原蛋白等電點(diǎn)是不同的。酸溶膠原蛋白、超聲波輔助提取膠原蛋白、熱水提取膠原蛋白的等電點(diǎn)分別為6.9、6.8、5.9。酸法提取及超聲波輔助酶法提取膠原蛋白的等電點(diǎn)在中性范圍內(nèi)，說明其側(cè)鏈氨基酸殘基沒有被破壞，而熱水提取的膠原蛋白等電點(diǎn)為5.9，說明其側(cè)鏈酰胺基被水解，產(chǎn)生羧基殘基，因此，等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi)。Swatschek等[19]研究海綿膠原蛋白的等電點(diǎn)在6.5～8.5之間，F(xiàn)riess[20]研究發(fā)現(xiàn)牛皮膠原蛋白等電點(diǎn)為7.00±0.09，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。

3 結(jié) 論

熱水法提取、酸法提取及超聲輔助酶法提取膠原蛋白均具有Ⅰ型膠原蛋白特征，紫外光譜吸收特性峰在220～232 nm之間，變性溫度都在31 ℃附近，特征氨基酸含量差異不顯著。熱水提取方法所得膠原蛋白凝膠強(qiáng)度增加，黏度下降，等電點(diǎn)降低至酸性范圍。

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Effect of Extraction Methods on Physico-chemical Properties of Collagen from Tilapia Shin

HAO Shu-xian, LIN Wan-ling, LI Lai-hao, YANG Xian-qing, ZHOU Wan-jun, HUANG Hui, WEI Ya, CEN Jian-wei, YE Ge
(Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic Product Processing, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)

The purpose of this work is to compare the physico-chemical properties of collagen extracted from tilapia skin by different methods, hot water extraction, acid extraction and ultrasonic-assisted enzymatic extraction. The collagens exhibited distinctive absorption peaks in the wavelength range of 220-232 nm. There was no significant difference in the contents of hydroxyproline or praline. Gel strength of collagen extracted with hot water was higher than that from other extraction methods, while intrinsic viscosity of collagen extracted with citric acid was the highest. The denaturalization temperature of tilapia skin collagen was about 31 ℃ regardless of extraction methods. The isoelectric point (pI 5.9) of collagen extracted with hot water was lower than that (pI 7) of collagens extracted by other methods.

tilapia skin; collagen; extraction; physico-chemical properties

TS254.4

A

1002-6630（2014）15-0059-04

10.7506/spkx1002-6630-201415012

2013-07-11

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（羅非魚）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-49）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B00）；茂名市重大科技專項(xiàng)（2011A01002）；農(nóng)業(yè)部中央級(jí)公益性科研院所基本科研項(xiàng)目（2010YD07；2012TS22）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（11107005-2）

郝淑賢（1972—），女，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。E-mail：susanhao2001@163.com