燕 華，李 衛(wèi)

（1.河南省鄭州市兒童醫(yī)院血液科 450053；2.廣西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，南寧530021）

急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓系白血?。ˋML）的一種特殊類型，染色體異位t（15；17）和（PML／RARa）融合基因陽(yáng)性是其惟一的形態(tài)學(xué)特征，約占AML的10%～15%，臨床特征易導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）[1]。柔紅霉素（DNR）可與DNA結(jié)合，并抑制核酸的生物合成，是目前治療AML的主要化療藥物之一。盡管目前通過(guò)DNR、維甲酸等治療已經(jīng)可以使初治患者的完全緩解率大幅度增加，但仍有部分患者由于病情復(fù)發(fā)而死亡，其中原因之一就是白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥。耐藥性的產(chǎn)生是由多種機(jī)制作用而產(chǎn)生的，其中主要包括ATP依賴的能量泵活性增強(qiáng)使細(xì)胞內(nèi)藥物外排增加、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ表達(dá)改變使增加腫瘤細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)能力增強(qiáng)以及腫瘤細(xì)胞凋亡減少而產(chǎn)生的耐藥性等[2-4]。耐藥基因主要包括多藥耐藥基因（MDR1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白基因（MRP）、肺耐藥蛋白基因（LRP）、乳腺癌耐藥蛋白基因（BCRP）等。目前，隨著miRNA研究的不斷深入，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與白血病及其耐藥方面存在密切的聯(lián)系。

miRNA是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸，非編碼的RNAs，廣泛存在于真核生物中，在后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控mRNA的表達(dá)[5]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，miRNA參與許多生物學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞增殖，分化和凋亡等，人類大約30%的基因受到miRNA的調(diào)節(jié)[6-7]。近年來(lái)，miRNA與胃癌、乳腺癌、卵巢癌等相關(guān)的多藥耐藥miRNA相繼報(bào)道，在白血病多藥耐藥方面也引起了越來(lái)越多的關(guān)注。目前，在其他腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA-21、miRNA-125b、miRNA-181d、miRNA-27a和let-7f等5種 miRNA可能與耐藥相關(guān)，但關(guān)于他們?cè)贖L-60細(xì)胞中的表達(dá)及DNR對(duì)他們的影響鮮有報(bào)道，因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)這5種miRNA在HL-60中的表達(dá)情況，并探討DNR對(duì)這些表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人APL藥物敏感細(xì)胞HL-60購(gòu)自武漢博士德公司。人APL耐藥細(xì)胞HL-60／A購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，該細(xì)胞可在500ng／mL的阿霉素培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclong公司，國(guó)產(chǎn)四季青胎牛血清（FBS），浙江海正藥業(yè)有限公司的鹽酸DNR，Small RNA提取試劑購(gòu)于TaKaRa公司的RNAiso for small RNA。逆轉(zhuǎn)錄PCR和RT-PCR試劑盒購(gòu)自Gene CopoeiaTM公司。噻唑藍(lán)（MTT）美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)配5mg／mL溶液。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60和HL-60／A置于RPMI1640培養(yǎng)液中（100mL里含有10mL FBS），于37℃、50mL／L CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中穩(wěn)定生長(zhǎng)。細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，正常情況2～3d更換1次新鮮培養(yǎng)基。HL-60／A以500 ng／mL的DNR維持耐藥表型。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1和對(duì)照組2。其中實(shí)驗(yàn)組以小劑量（10ng／mL）的DNR持續(xù)作用于HL-60敏感細(xì)胞，并于用藥后第1、7、14和28天檢測(cè)細(xì)胞的抑制率及miRNA的表達(dá)。對(duì)照組1和2分別是HL-60／A耐藥細(xì)胞和不接受DNR持續(xù)作用的HL-60敏感細(xì)胞。對(duì)照組1要以500 ng／mL的DNR維持其耐藥表型。

1.3.3 四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法檢測(cè)小劑量DNR持續(xù)作用對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制率 用10ng／mL的DNR持續(xù)作用于HL-60DNR敏感細(xì)胞，然后分別在DNR作用后的第1、3、5、7、10和14天取等量的細(xì)胞做MTT實(shí)驗(yàn)。按照上述實(shí)驗(yàn)方法，調(diào)整細(xì)胞密度，每孔取200μL接種于96孔培養(yǎng)板中，其中實(shí)驗(yàn)組分別加入4、8和16ng／mL的DNR，對(duì)照組1加入與實(shí)驗(yàn)組最大DNR用量等體積的生理鹽水，對(duì)照組2只含有培養(yǎng)基無(wú)細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)孔培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后加入MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后2 000r／min離心10min，小心吸去上清液，每孔再分別加入150μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩至MTT完全溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔490nm波長(zhǎng)的吸光度（A）值，繪制小劑量DNR作用不同時(shí)間后對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制率曲線。

1.3.4 microRNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 按說(shuō)明用TaKaRa公司的RNAiso for small RNA試劑盒分別提取各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的miRNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)A260和A280，計(jì)算濃度，并用15g／L的瓊脂糖凝膠跑電泳檢測(cè)miRNA的完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在25μL逆轉(zhuǎn)錄體系中含有5×RT Buffer、miRNA模板300ng、2.5UPoly A Polymerase和RTase Mix 1μL。反應(yīng)條件為37℃60min，85℃5min。所得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用滅菌水稀釋10倍進(jìn)行下一步PCR實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 RT-PCR檢測(cè)miRNA的表達(dá) RT-PCR的下游引物為ALL-in-oneTM miRNA RT-PCR試劑盒提供的通用引物（Universal adaptor PCR Primer），上游引物用 Primer Premier 5.0軟件按照引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由上海生工合成。miR-181d上游：5′-GCG GGA ACA TTC ATT GTT GT-3′；miR-125b上游：5′-GCT CCC TGA GAC CCT AAC TTG-3′；let-7f上游：5′-GGG GGT GAG GTA GTA GAT TGT AT-3′；miR-27a上游：5′-GGA GGG CTT AGC TGC TTG TGA-3′；內(nèi)參U6和miRNA-21的上下游引物由ALL-in-oneTM miRNA RT-PCR試劑盒提供。20μL PCR反應(yīng)體系中含有2×ALL-in-one Qpcr Mix，PCR Forward Primer（2μmol／L）1.5 μL，Universal Adaptor PCR Primer（2μmol／L）1.5μL，10倍稀釋的cDNA模板4.0μL和50×ROX Reference Dyeiv 0.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：95預(yù)變性10min。95℃變性10s，60℃退火40s，72℃延伸40s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。各樣本均重復(fù)3孔，以平均CT值（閾值循環(huán)數(shù)）作為每個(gè)樣本的CT值。并以U6為內(nèi)參，采用相對(duì)定量2-△△CT法進(jìn)行miRNA相對(duì)定量的比較。樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)用2-△△CT方法計(jì)算，即Fold change＝2-△△CT＝2-[待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組管家基因平均Ct值]-[對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組管家基因平均Ct值]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小劑量DNR持續(xù)作用對(duì)HL-60敏感細(xì)胞的抑制率 以10ng／mL的DNR持續(xù)作用于HL-60細(xì)胞，然后于用藥后第1、3、5、7、10和14天，再分別以4、8和16ng／mL等3種濃度的DNR做48h的MTT實(shí)驗(yàn)，觀察DNR對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，見(jiàn)表1。隨著DNR作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度的抑制率逐漸減小，且在加藥的第10天左右，逐漸進(jìn)入1個(gè)平臺(tái)期，表明隨著小劑量DNR的持續(xù)作用，HL-60敏感細(xì)胞可能在用藥后的第10天左右逐漸對(duì)DNR產(chǎn)生耐藥，見(jiàn)圖1。

表1 小劑量DNR持續(xù)作用對(duì)HL-60敏感細(xì)胞的抑制率（±s，%）

表1 小劑量DNR持續(xù)作用對(duì)HL-60敏感細(xì)胞的抑制率（±s，%）

濃度（ng／mL） 加藥第1天 加藥第3天 加藥第5天 加藥第7天 加藥第10天 加藥第14天4 18.60±1.15 15.40±1.12 9.50±0.97 7.50±1.184.40±0.25 3.20±0.93 8 26.70±3.19 16.60±1.22 13.70±0.85 11.50±1.20 6.90±0.93 7.60±0.75 16 33.80±3.17 27.60±2.58 16.50±2.06 14.90±1.19 9.60±1.00 10.90±1.04

圖1 DNR作用miRNA-21表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 DNR作用miRNA-125b表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖3 DNR作用miRNA-181d表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4 DNR作用let-7f表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖5 DNR作用miRNA-27a表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 miRNA RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照2組比較，miRNA-21和miRNA-125b在對(duì)照1組中的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞則從加藥的第7天起表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；相反，miRNA-181d、miRNA-27a、let-7f在對(duì)照1組中的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），而在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中則是在加藥后的第7天開(kāi)始下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖1～5。

3 討 論

抗癌藥物的耐藥性因人而異，原因很多，其中miRNA也是一個(gè)重要的影響因素之一。miRNA的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，一種miRNA可以作用于多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因也可以受多種miRNA調(diào)控。在多種人類癌癥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA-21表達(dá)上調(diào)。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miRNA-21在 MCR-7／ADR細(xì)胞中的表達(dá)可導(dǎo)致PTEN蛋白下調(diào)，miRNA-21的模擬物和抑制物明顯影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。轉(zhuǎn)染了抗miRNA-21寡核苷酸（anti-miRNA-21oligonucleotide，AMO-miRNA-21）的細(xì)胞可增加HL-60細(xì)胞對(duì)Ara-C的敏感性，并證實(shí)AMO-miRNA-21的作用可能是通過(guò)上調(diào)PDCD4來(lái)實(shí)現(xiàn)[9]。隨后在耐DNR的K562白血病耐藥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miRNA-21明顯上調(diào)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-21可以調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，影響PI3K／AKt通路，從而起到調(diào)節(jié)K562細(xì)胞對(duì)DNR的耐藥性[10]。Zhu等[11]通過(guò)對(duì)比多藥耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞，證實(shí)miRNA-125b和miRNA-27a在人類耐藥的卵巢癌細(xì)胞和子宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b在兒童APL細(xì)胞中高表達(dá)，并且進(jìn)一步證實(shí)miRNA-125b可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因Bak1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b在HL-60／DOX、K562／DOX、NB4-R1和 NB4-R2這4種白血病耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。這些研究均表明miRNA-21和miRNA-125b可能與腫瘤的耐藥相關(guān)。本研究首先使用低濃度DNR藥物作用于HL-60敏感細(xì)胞，然后于用藥后的第1、3、5、7、10和14天用不同濃度的DNR測(cè)試細(xì)胞的MTT反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著小劑量DNR持續(xù)作用時(shí)間的延長(zhǎng)，DNR對(duì)于HL-60細(xì)胞增殖的抑制率逐漸減小，并在用藥后的第10天左右逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，提示HL-60敏感細(xì)胞可能在小劑量DNR持續(xù)作用10d左右開(kāi)始產(chǎn)生耐藥。同時(shí)，筆者采用RT-PCR檢測(cè)DNR不同作用時(shí)間HL-60敏感細(xì)胞中miRNA-21、miRNA-181d、miRNA-125b、let-7f和miRNA-27a5種miRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HL-60／A耐藥細(xì)胞中的miRNA-21和miRNA-125b表達(dá)明顯上調(diào)，而敏感細(xì)胞的miRNA-21和miRNA-125b表達(dá)也在小劑量DNR作用后的第7天起出現(xiàn)顯著上調(diào)，提示miRNA-21和miRNA-125b的表達(dá)上調(diào)可能與HL-60對(duì)DNR產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。

Eric等[13]利用miRNA微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞敏感株MYL與耐伊馬替尼耐藥株MYL-R大約有30種miRNA的表達(dá)出現(xiàn)超過(guò)2倍以上的差異。其中miRNA181（a～d）家族在耐藥細(xì)胞株中明顯下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-181d在HL-60／A耐藥細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而敏感細(xì)胞則在用藥后的第7天起出現(xiàn)下調(diào)，與上述結(jié)果一致。Feng等[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在白血病細(xì)胞中miRNA27a和miRNA-331-5p與耐藥基因P-gp的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，并對(duì)K562耐藥細(xì)胞和HL-60 DOX耐藥細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miRNA27a和miRNA-331-5p，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后可以增加耐藥細(xì)胞對(duì)DNR藥物的敏感性。Let-7最初發(fā)現(xiàn)是參與調(diào)節(jié)線蟲(chóng)發(fā)育時(shí)序，Yang等[15]的研究表明，let-7i在耐藥的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并且減少let-7i的表達(dá)量可以明顯的增加卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗性。本研究也發(fā)現(xiàn)，miRNA-181d、miRNA-27a和let-7f在 HL-60／A耐藥細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，而HL-60敏感細(xì)胞則在持續(xù)用藥的第7天起表達(dá)下調(diào)，提示miRNA-181d、let-7f和miRNA27a的表達(dá)下調(diào)也可能與HL-60細(xì)胞對(duì)DNR的耐藥性也具有一定的相關(guān)性。

綜上所述，本研究對(duì)5種miRNA在HL-60細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了探索，對(duì)這5種miRNA與HL-60細(xì)胞耐藥性的相關(guān)性有了初步的認(rèn)識(shí)。今后還需要通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA特異的寡核苷酸模擬物及抑制物等手段，進(jìn)一步了解這些miRNA的靶基因及其作用機(jī)制，為降低APL的耐藥性，提高藥物化療效果打下理論基礎(chǔ)。

[1] Su YC，Dunn P，Shih LY，et al.Retinoic acid syndrome in patients following the treatment of acute promyelocytic leukemia with all-trans retinoic acid[J].Chang Gung Med J，2009，32（5）：535-542.

[2] Sun YL，Patel A，Kumar P，et al.Role of ABC transporters in cancer chemotherapy[J].Chin J Cancer，2012，31（2）：51-57.

[3] Calin GA，Liu CG，Sevignani C，et al.MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（32）：11755-11760.

[4] Hong L，Piao Y，Han Y，et al.Zinc ribbon domain-containing 1（ZNRD1）mediates multidrug resistance of leukemia cells through regulation of P-glycoprotein and Bcl-2[J].Mol Cancer Ther，2005，4（12）：1936-1942.

[5] Zhao Y，Srivastava D.A developmental view of microRNA function[J].Trends Biochem Sci，2007，32（4）：189-197.

[6] Carleton M，Cleary MA，Linsley PS.MicroRNAs and cell cycle regulation[J].Cell Cycle，2007，6（17）：2127-132.

[7] Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[8] Wang ZX，Lu BB，Wang H，et al.MicroRNA-21modulates chemosensitivity of breast cancer cells to doxorubicin by targeting PTEN[J].Arch Med Res，2011，42（4）：281-290.

[9] Li Y，Zhu X，Gu J，et al.Anti-miR-21oligonucleotide enhances chemosensitivity of leukemic HL60cells to arabinosylcytosine by inducing apoptosis[J].Hematology，2010，15（4）：215-221.

[10] Bai H，Xu R，Cao Z，et al.Involvement of miR-21in resistance to daunorubicin by regulating PTEN expression in the leukaemia K562cell line[J].FEBS Lett，2011，585（2）：402-408.

[11] Zhu H，Wu H，Liu X，et al.Role of MicroRNA miR-27a and miR-451in the regulation of MDR1／P-glycoprotein expression in human cancer cells[J].Biochem Pharmacol，2008，76（5）：582-588.

[12] Zhang H，Luo XQ，F(xiàn)eng DD，et al.Upregulation of microRNA-125bcontributes to leukemogenesis and increases drug resistance in pediatric acute promyelocytic leukemia[J].Mol Cancer，2011，10：108.

[13] Zimmerman EI，Dollins CM，Crawford M，et al.Lyn kinase-dependent regulation of miR181and myeloid cell leukemia-1expression：implications for drug resistance in myelogenous leukemia[J].Mol Pharmacol，2010，78（5）：811-817.

[14] Feng DD，Zhang H，Zhang P，et al.Down-regulated miR-331-5p and miR-27aare associated with chemotherapy resistance and relapse in leukaemia78（5）[J].J Cell Mol Med，2011，15（10）：2164-2175.

[15] Yang N，Kaur S，Volinia S，et al.MicroRNA microarray identifies Let-7ias a novel biomarker and therapeutic target in human epithelial ovarian cancer[J].Cancer Res，2008，68（24）：10307-10314.