鄧飛鴻，聶 飚，左俊華，柳雪花，陳金敏

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科，廣州510515）

大腸癌發(fā)病率是腫瘤中的第2位，而且逐年升高，占新發(fā)病數(shù)的9.4%[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單克隆抗體包括西妥昔單抗和帕尼單抗。其中，西妥昔單抗是一種人-鼠嵌合型IgG單克隆抗體，而帕尼單抗是一種完全人源化的IgG單抗。最初認(rèn)為EGFR單抗與EGFR的細(xì)胞外區(qū)結(jié)合，從而阻斷表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）等配體的結(jié)合，抑制其下游信號(hào)的傳導(dǎo)。所以，僅被用于EGFR表達(dá)陽(yáng)性的患者；但隨后研究發(fā)現(xiàn)，EGFR表達(dá)陽(yáng)性與EGFR單抗的療效沒(méi)有顯著相關(guān)性，EGFR表達(dá)水平并不能作為EGFR單抗療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)[2-3]。目前，美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）推薦在使用抗EGFR單克隆抗體進(jìn)行治療之前，先對(duì)患者進(jìn)行KRAS和BRAF基因突變檢測(cè)；對(duì)于存在KRAS和BRAF突變的患者，不推薦使用抗EGFR單克隆抗體進(jìn)行治療。筆者前期發(fā)現(xiàn)，相關(guān)病毒-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子K1（AAV-HGFK1）主要通過(guò)抑制磷酸化EGFR（p-EGFR）降低大腸癌細(xì)胞增殖，選擇人源的KRAS和BRAF野生的細(xì)胞株SW48，KRAS突變的細(xì)胞株Lovo，BRAF突變的細(xì)胞株HT29，用腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）攜帶 HGFK1構(gòu)建的基因治療藥物實(shí)驗(yàn)對(duì)大腸癌細(xì)胞的作用[4-5]。在大腸癌細(xì)胞中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（hepatocyte growth factor receptor，HGFR）高表達(dá)，HGFR是原癌基因c-met編碼的蛋白。HGF是由鏈和鏈連接形成的，鏈有一個(gè)N末端發(fā)卡結(jié)構(gòu)和4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)功能區(qū)[6]。體內(nèi)天然存在的突變體NK1-4與HGFR結(jié)合但不使HGFR磷酸化，成為天然的HGF拮抗劑，具有抑制腫瘤血管生成的潛在治療作用，因?yàn)镠GF參與腫瘤新生血管生成[7-9]。筆者前期發(fā)現(xiàn)，AAV-HGFK1主要通過(guò)抑制EGFR磷酸化降低大腸癌細(xì)胞增殖[5]，本研究選擇人源的KRAS和BRAF野生的細(xì)胞株SW48、KRAS突變的細(xì)胞株Lovo，BRAF突變的細(xì)胞株HT29，用AAV攜帶HGFK1構(gòu)建的基因治療藥物實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)大腸癌細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、G418、臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自Sigma公司，羊抗人HGFK1多克隆抗體由香港大學(xué)制備，人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo、SW48、HT29和SW620購(gòu)自ATCC公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基（含4.5g／L葡萄糖），置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR） 六孔板中接種5×105個(gè)／孔，培養(yǎng)12h。總RNAs用商品化試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取 （Trizol，Gibco BRL，USA）。10mg總RNA用SuperScriptTMⅢ（Synthesis Kit，Invitrogen，USA）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA模板用人的EGFR特異性引物PCR擴(kuò)增。EGFR引物：正向，5′-AAT GTG AGC AGA GGC AGG GA-3′；反向，5′-GGC TTG GTT TGG AGC TTC TC-3′）。

1.2.3 病毒制備 質(zhì)粒pAAV-CAG-sec-EGFP和pAAVCAG-sec-HGFK1是通過(guò)插入EGFP和人類HGFK1cDNA到多克隆位點(diǎn)AAV血清型2載體獲得，重組AAV顆粒通過(guò)無(wú)輔助病毒的系統(tǒng)生產(chǎn)。

1.2.4 AAV-EGFP對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，24孔板1×105／孔種植細(xì)胞，培養(yǎng)12h，設(shè)陰性對(duì)照組，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次后，病毒和無(wú)血清培養(yǎng)液混勻液加入24孔板的細(xì)胞中，37℃孵育2h，棄去培養(yǎng)基，更換新鮮的培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)4d和7d，在熒光顯微鏡下觀察AAV和Adv感染的細(xì)胞是否表達(dá)熒光蛋白。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）雜交 六孔板中種植2×105個(gè)／孔，培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞黏附后用AAV-EGFP或AAVHGFK1（MOI＝5×104vg／細(xì)胞）0.2%FBS的培養(yǎng)基孵育48 h用不同濃度的EGF同時(shí)加入培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后，刮取細(xì)胞，提取總蛋白為 Western blot檢測(cè)備用。對(duì)于Western blot，標(biāo)本先用pH 7.9含有10.0mmol／L HEPES、10.0mmol／L KCl、1.5mmol／L MgCl2、0.5mmol／L DTT、0.5 mmol／L PMSF、10.0μg／mL抑酞酶和10.0μg／mL亮肽酶素緩沖液處理?？偟鞍子檬榛蛩徕c-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)過(guò)封閉后，膜分別用一抗和二抗室溫孵育1h，一抗為抗EGFR、p-EGFR和βactin（Santa Cruz Biotechnology，CA）。用ECL試劑盒檢測(cè)發(fā)光信號(hào)（Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Buckinghamshire，UK）。

1.2.6 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法測(cè)定細(xì)胞增殖，96孔板中每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20 μL反應(yīng)后用 Meter Tech 960型酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值）。同時(shí)，用不同數(shù)量的以上種類細(xì)胞接種到96孔板中，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算細(xì)胞增殖率。同一個(gè)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，設(shè)對(duì)照孔（RPMI 1640培養(yǎng)基）和空白孔（無(wú)細(xì)胞），每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。AAV-EGFP或AAV-HGFK1各組間比較采用t檢驗(yàn)，不同濃度EGF加入細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用雙因素方差分析，多組間比較采用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AAV-EGFP感染后EGFP陽(yáng)性率 5×104vg／細(xì)胞的AAV-EGFP感染Lovo、HT29、SW48、SW620后培養(yǎng)4d和7 d后，分別消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞檢測(cè)EGFP綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，感染7d后陽(yáng)性率均大于90%，見(jiàn)圖1。

2.2 Lovo、HT29、SW48細(xì)胞中EGFR的表達(dá)情況 采用RT-PCR檢測(cè)EGFR mRNA在Lovo和HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平較高，而SW48中的轉(zhuǎn)錄較低，SW620未檢測(cè)到（圖2）。Western blot顯示HT29為45.3倍Lovo為21.5倍SW48為1.0倍，SW620未檢測(cè)到，見(jiàn)圖3。

圖1 AAV-EGFP感染Lovo、HT29、SW48、SW620后時(shí)間-EGFP陽(yáng)性率曲線

圖2 RT-PCR檢測(cè)Lovo、HT29、SW48、SW620中EGFR mRNA的表達(dá)

圖3 AAV-EGFP和AAV-HGFK1感染Lovo、HT29、SW48、SW620后 Western blot檢測(cè)EGFR、p-EGFR蛋白的表達(dá)

圖4 感染后MTT檢測(cè)4種細(xì)胞在含有EGF的無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

2.3 AAV-HGFK抑制EGFR磷酸化 常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行病毒感染，7d后提取總蛋白，Western blot檢測(cè)EGFR和p-EGFR，發(fā)現(xiàn)AAV-HGFK1感染的Lovo、HT29、SW48細(xì)胞p-EGFR顯著低于AAV-EGFP感染的對(duì)照，提示AAV-HGFK1顯著抑制了EGFR磷酸化，表明HGFK1是EGFR磷酸化的抑制劑，見(jiàn)圖3。

2.4 AAV-HGFK1顯著抑制了大腸癌細(xì)胞增殖 常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行病毒感染7d后，胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液1×103個(gè)／孔分別接種96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜貼壁作為0小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，大腸癌細(xì)胞株分別用每孔100μL無(wú)FBS的PRIM1640加入或不加EGF培養(yǎng)72h。2、20ng／mL的EGF顯著刺激了無(wú)血清培養(yǎng)液中Lovo、HT29、SW48細(xì)胞的增殖，SW620的增殖無(wú)顯著作用，AAV-HGFK1感染顯著抑制了EGF刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，抑制率都超過(guò)60%。為檢測(cè)HGFK1是否可能通過(guò)抑制其他生長(zhǎng)因子的作用抑制SW620的增殖，SW620在0.3%和0.6%FBS中培養(yǎng)，AAV-HGFK1感染對(duì)的增殖速度有顯著抑制作用，抑制率為22%和26%，見(jiàn)圖4、5。

圖5 感染SW620后MTT檢測(cè)基在含有FBS增養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

3 討 論

HGFK1是HGF第一個(gè)Kringle環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的基因表達(dá)產(chǎn)物，是由79個(gè)氨基酸構(gòu)成的球形結(jié)構(gòu)，位于 HGF的第128～206位氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量11×105[10]。自 Xin等[11]發(fā)現(xiàn)HGFK1具有抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)牛動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用后，HGFK1作為一個(gè)新的抗腫瘤因子開(kāi)始成為研究的焦點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)4種結(jié)腸癌細(xì)胞系（Lovo、HT29、SW48、SW620）分別應(yīng)用RT-PCR、Western blot方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在Lovo、HT29、SW48 3種細(xì)胞中可以檢測(cè)到EGFR表達(dá)，在SW620細(xì)胞中未檢測(cè)到。AAV-HGFK1感染Lovo、HT29、SW48細(xì)胞p-EGFR顯著低于其對(duì)照組。MTT實(shí)驗(yàn)證明，HGFK1可以抑制EGF介導(dǎo)的促進(jìn)Lovo、HT29、SW48腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用，說(shuō)明HGFK1可以通過(guò)EGFR信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。SW620中雖然未檢測(cè)到EGFR的表達(dá)，但是在含0.3%和0.6%FBS中培養(yǎng)，AAV-HGFK1感染對(duì)其增殖速度有顯著抑制作用，說(shuō)明HGFK1可以通過(guò)其他通路抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

已有研究表明，EGFR信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，EGFR 主要有 Ras／Raf／MEK／ERK 和 P13K／PDKl／Akt兩條信號(hào)通路[12]。以往研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因突變的患者對(duì)EGFR單抗治療無(wú)效。而近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)，約40%KRAS基因野生型患者有耐藥現(xiàn)象。究其原因可能是與EGFR表達(dá)異常及EGFR通路中的其他基因如BRAF突變等因素相關(guān)，結(jié)果導(dǎo)致EGFR下游的分子信號(hào)通路異常活化[13]。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)表明，HGFK1對(duì)表達(dá)EGFR同時(shí)伴或不伴KRAS和BRAF突變的大腸癌細(xì)胞及不表達(dá)EGFR的大腸癌細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，是一種腫瘤抑制因子，可能作為大腸癌治療的新藥物。這種關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，為今后深入研究HGFK1治療大腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Shen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，HGFK1抗腫瘤細(xì)胞及抗血管形成效應(yīng)主要是通過(guò)EGF／EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路，部分通過(guò) VEGF／VEGFR和bFGF／Flg信號(hào)傳導(dǎo)通路，而不是通過(guò)HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖效應(yīng)。在大鼠肝癌模型中，AAV-HGFK1治療組顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低腫瘤微血管密度，并完全阻止肝、肺、腹膜轉(zhuǎn)移。筆者前期研究已證明rAAV-HGFK1聯(lián)合Ad-p53延長(zhǎng)肝轉(zhuǎn)移大腸癌小鼠生存[4]。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HGFK1有效抑制人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移，并且在小鼠體內(nèi)抑制脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜新生血管形成。Zhou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)HGFK1的非小細(xì)胞肺癌患者總生存期及無(wú)進(jìn)展生存期顯著長(zhǎng)于不表達(dá)HGFK1的非小細(xì)胞肺癌患者。

綜上所述，目前對(duì)HGFK1作用機(jī)制的研究正逐漸明朗，使HGFK1作為一種新型靶向治療腫瘤藥物進(jìn)入臨床成為可能。

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