羅丹，羅國安，陳麗，馬晉芳，王義明

得力生注射液是抗腫瘤藥物，是由紅參、黃芪、蟾酥和斑蝥4味中藥組成的復(fù)方靜脈注射液，具有益氣化瘀、軟堅散結(jié)之功效，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及再分化，抑制多種腫瘤細(xì)胞生長，對放療和化療不敏感的腺型癌細(xì)胞也有很強的抑制作用和顯著的鎮(zhèn)痛作用，還可清除體內(nèi)自由基，顯著提高機體的免疫功能[1,2]。

關(guān)于得力生注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，目前僅見關(guān)于其中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的相關(guān)報道[3]。然而，國家藥品監(jiān)督管理局頒布的《中藥注射劑安全性再評價質(zhì)量控制評價技術(shù)原則（試行）》中明確規(guī)定：“多成份制成的注射劑應(yīng)分別采用專屬性的方法（如HPLC和/或GC等定量方法）測定各主要結(jié)構(gòu)類型成份中至少一種代表性成份的含量，其中含量測定指標(biāo)成分的選擇應(yīng)包括大類成分和單一成分的含量測定。在對得力生注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)研究中，我們已建立了得力生注射液中單糖及蔗糖含量的測定方法[4]。得力生注射液中配伍藥材黃芪具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血等功效，為扶正補虛之要藥，現(xiàn)代研究表明，黃芪中主要活性成分黃芪甲苷具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、保護腎上腺皮質(zhì)和骨髓功能的效應(yīng)[5,6]。本文用HPLCELSD建立了得力生注射液中黃芪甲苷的含量測定方法，為產(chǎn)品質(zhì)量的提高提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100系列高效液相色譜儀（配備二元泵，柱溫箱等；Agilent公司）；Alltech2000蒸發(fā)光散射檢測器（Alltech公司），浙江大學(xué)N2000色譜工作站；超純水儀（Milli-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)）；XP205型電子天平（d=0.01mg；瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功500W，頻率40KHz)。

乙腈（色譜純，fisher公司）， 超純水（Milli Q Synthesis 超純水純化系統(tǒng)制， 過0.2μm 微孔濾膜）；正丁醇、氨水、乙醇等其他試劑均為分析純；D101型大孔吸附樹脂（天津海光化工有限公司生產(chǎn)）。

黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110808-200508，含量測定用，純度大于98%）。得力生注射液模型制劑按工藝制備，得力生注射液（批號：101101，101102，101103）及各配伍藥材均由山東正邦制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltech AlltimaC18（4.6×250 mm, 5 μm）；流動相：乙腈-水（32∶68）；流速：1 mL．min-1；柱溫：30℃；蒸發(fā)光散射檢測器（干燥氣流速2.7 L．min-1；漂移管溫度100℃）；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1.3 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取得力生注射液100 mL，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用95%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜0.45 μm濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方量制備缺黃芪藥材的得力生注射液樣品，按“2.2.2”項下制備成陰性對照液。

2.3 干擾實驗

精密吸取黃芪甲苷對照品溶液、得力生注射液供試品溶液、陰性對照液各20 μL，分別注入液相色譜儀，在“2.1”色譜條件下測定，記錄色譜圖（見圖1）。在得力生注射液供試液色譜圖中，與對照品色譜圖相應(yīng)位置（tR=26.0 min）上，確認(rèn)了黃芪甲苷色譜峰，而陰性對照液色譜圖無黃芪甲苷的色譜峰，故認(rèn)為無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.標(biāo)準(zhǔn)品；B.藥材；C.提取液；D.注射液；1.黃芪甲苷

2.4 線性關(guān)系考察

將“2.2.1”黃芪甲苷對照品配制成質(zhì)量濃度分別為0.065 mg．mL-1，0.262 mg．mL-1，0.524 mg．mL-1，0.786 mg．mL-1，1.048 mg．mL-1，1.310 mg．mL-1的系列濃度對照品溶液，在“2.1”色譜條件下測定，以對照品質(zhì)量濃度（mg．mL-1）的對數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=1.5615X+4.5659，相關(guān)系數(shù)：r=0.9993（n=6），表明在0.065～1.310 mg．mL-1之間呈良好的線性關(guān)系。

2.5 最低定量限及檢測限

采用信噪比法檢測黃芪甲苷的檢測限及定量限。以信噪比為3∶1時相應(yīng)濃度確定其檢測限，以信噪比為10∶1時相應(yīng)濃度確定其定量限。將黃芪甲苷對照品溶液稀釋一定倍數(shù)，分別自動進(jìn)樣20 μL，得到黃芪甲苷的檢出限及定量限。檢測限為：0.434 μg。定量限為：1.300 μg。

2.6 精密度實驗

精密吸取黃芪甲苷對照品溶液，按“2.1”色譜條件連續(xù)測定6次， 記錄峰面積，測得黃芪甲苷的精密度（RSD）為0.14%，表明精密度良好。

2.7 重復(fù)性實驗

精密量取得力生注射液，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法制備6份得力生注射液供試品溶液，按“2.1”色譜條件依次測定，記錄色譜峰峰面積，測得黃芪甲苷峰面積的RSD為3.47%（n=6），結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性實驗

分別精密吸取室溫下放置的得力生注射液供試品溶液，分別在配制后0，2，4，6，8和12 h，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，測定黃芪甲苷峰面積，計算RSD為3.12%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率實驗

精密量取已知含量的得力生注射液50 mL，共9份，按80%，100%，150% 3個目標(biāo)濃度，分別精密加入黃芪甲苷對照品適量，每一質(zhì)量濃度取3份，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定，計算平均回收率為100.1%，RSD為3.7%。結(jié)果見表1。

表1 回收率實驗結(jié)果 (n=9)

2.10 樣品測定

取3批得力生注射液供試品溶液各20 μL，采用“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，測定黃芪甲苷的含量。結(jié)果表明，3批得力生注射液（批號101101，101102，101103）中黃芪甲苷的含量分別為12.84 μg．mL-1、12.58 μg．mL-1、16.12 μg．mL-1。

3 討論

黃芪甲苷為得力生注射液中黃芪扶正祛邪，調(diào)節(jié)機體免疫功能的主要活性成分。本研究建立了該成分含量測定方法，方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠有效控制該制劑質(zhì)量。

鑒于黃芪甲苷的紫外最大吸收波長在200 nm ，屬有末端吸收[8]，故本研究采用HPLC-ELSD測定黃芪甲苷的含量。通過對蒸發(fā)光檢測器溫度和載氣流量等考察，當(dāng)檢測器溫度100℃；載氣流量：2.7 L．mL-1黃芪皂苷的響應(yīng)值較好，并且有較好的分離度。同時對不同流動相體系甲醇-水、乙腈-水，及不同流動相比例進(jìn)行考察，確定乙腈-水（32∶68）為流動相具有較好的分離度。

由于得力生注射液由紅參、黃芪、蟾酥和斑蝥四味藥材提取物制成，干擾成分較多。目前尚未見得力生注射液中黃芪甲苷的含量測定方法。本研究對黃芪甲苷的富集方法進(jìn)行優(yōu)化。采用大孔樹脂法、水飽和正丁醇萃取法和SPE固相萃取法分別制備供試品溶液，結(jié)果表明，3種方法測定結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)差異。在獲得較好實驗結(jié)果的前提下，考慮到方法重現(xiàn)性、檢測成本等因素，最終采用大孔吸附樹脂法富集得力生注射液中黃芪甲苷。對大孔樹脂類型和洗脫梯度進(jìn)行考察，確定D101型大孔吸附樹脂柱，以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用95%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解。這一前處理方法可有效去除極性成分，糖類等的干擾，實現(xiàn)黃芪甲苷準(zhǔn)確定量。

[1] 劉建新,路華,張玉珍,等.得力生聯(lián)合化療的體外抗癌活性[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2001, 22(5): 294.

[2] 孫建海,馬燕凌,彭明娥.化學(xué)治療聯(lián)合得力生注射液治療中晚期惡性腫瘤102例[J].醫(yī)藥導(dǎo)報, 2006, 25(6): 523.

[3] 高祥祥,張文婷,李秀玲,等.HPLC測定得力生注射液中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量[J].2006,11(28): 1709.

[4] 馬晉芳,陳麗,謝媛媛,等. HPLC-ELSD同時測定得力生注射液中單糖及蔗糖含量[J].藥物分析雜志,2012, 32(6): 998.

[5] 牛嵩山.黃芪甲苷的藥理研究進(jìn)展[J].國醫(yī)論壇, 2012, 27(4): 53.[6] 陳信義,雒琳.得力生注射液組方科學(xué)依據(jù)與臨床應(yīng)用前景分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2006,14(37):378.