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        HPLC-ELSD測定得力生注射液的黃芪甲苷的含量

        2014-03-08 09:02:04羅丹羅國安陳麗馬晉芳王義明
        中藥與臨床 2014年6期

        羅丹,羅國安,陳麗,馬晉芳,王義明

        得力生注射液是抗腫瘤藥物,是由紅參、黃芪、蟾酥和斑蝥4味中藥組成的復(fù)方靜脈注射液,具有益氣化瘀、軟堅散結(jié)之功效,能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及再分化,抑制多種腫瘤細(xì)胞生長,對放療和化療不敏感的腺型癌細(xì)胞也有很強的抑制作用和顯著的鎮(zhèn)痛作用,還可清除體內(nèi)自由基,顯著提高機體的免疫功能[1,2]。

        關(guān)于得力生注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究,目前僅見關(guān)于其中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的相關(guān)報道[3]。然而,國家藥品監(jiān)督管理局頒布的《中藥注射劑安全性再評價質(zhì)量控制評價技術(shù)原則(試行)》中明確規(guī)定:“多成份制成的注射劑應(yīng)分別采用專屬性的方法(如HPLC和/或GC等定量方法)測定各主要結(jié)構(gòu)類型成份中至少一種代表性成份的含量,其中含量測定指標(biāo)成分的選擇應(yīng)包括大類成分和單一成分的含量測定。在對得力生注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)研究中,我們已建立了得力生注射液中單糖及蔗糖含量的測定方法[4]。得力生注射液中配伍藥材黃芪具有補氣升陽,固表止汗,利水消腫,生津養(yǎng)血等功效,為扶正補虛之要藥,現(xiàn)代研究表明,黃芪中主要活性成分黃芪甲苷具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、保護腎上腺皮質(zhì)和骨髓功能的效應(yīng)[5,6]。本文用HPLCELSD建立了得力生注射液中黃芪甲苷的含量測定方法,為產(chǎn)品質(zhì)量的提高提供參考。

        1 儀器與試藥

        Agilent 1100系列高效液相色譜儀(配備二元泵,柱溫箱等;Agilent公司);Alltech2000蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech公司),浙江大學(xué)N2000色譜工作站;超純水儀(Milli-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng));XP205型電子天平(d=0.01mg;瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,功500W,頻率40KHz)。

        乙腈(色譜純,fisher公司), 超純水(Milli Q Synthesis 超純水純化系統(tǒng)制, 過0.2μm 微孔濾膜);正丁醇、氨水、乙醇等其他試劑均為分析純;D101型大孔吸附樹脂(天津海光化工有限公司生產(chǎn))。

        黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號為110808-200508,含量測定用,純度大于98%)。得力生注射液模型制劑按工藝制備,得力生注射液(批號:101101,101102,101103)及各配伍藥材均由山東正邦制藥有限公司提供。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:Alltech AlltimaC18(4.6×250 mm, 5 μm);流動相:乙腈-水(32∶68);流速:1 mL.min-1;柱溫:30℃;蒸發(fā)光散射檢測器(干燥氣流速2.7 L.min-1;漂移管溫度100℃);進(jìn)樣量:20 μL。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含1.3 mg的溶液,即得。

        2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取得力生注射液100 mL,通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm,柱高為12 cm),以水50 mL洗脫,棄去水液,再用40%乙醇30 mL洗脫,棄去洗脫液,繼用95%乙醇100 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘渣加甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用微孔濾膜0.45 μm濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

        2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方量制備缺黃芪藥材的得力生注射液樣品,按“2.2.2”項下制備成陰性對照液。

        2.3 干擾實驗

        精密吸取黃芪甲苷對照品溶液、得力生注射液供試品溶液、陰性對照液各20 μL,分別注入液相色譜儀,在“2.1”色譜條件下測定,記錄色譜圖(見圖1)。在得力生注射液供試液色譜圖中,與對照品色譜圖相應(yīng)位置(tR=26.0 min)上,確認(rèn)了黃芪甲苷色譜峰,而陰性對照液色譜圖無黃芪甲苷的色譜峰,故認(rèn)為無干擾。

        圖1 高效液相色譜圖A.標(biāo)準(zhǔn)品;B.藥材;C.提取液;D.注射液;1.黃芪甲苷

        2.4 線性關(guān)系考察

        將“2.2.1”黃芪甲苷對照品配制成質(zhì)量濃度分別為0.065 mg.mL-1,0.262 mg.mL-1,0.524 mg.mL-1,0.786 mg.mL-1,1.048 mg.mL-1,1.310 mg.mL-1的系列濃度對照品溶液,在“2.1”色譜條件下測定,以對照品質(zhì)量濃度(mg.mL-1)的對數(shù)為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=1.5615X+4.5659,相關(guān)系數(shù):r=0.9993(n=6),表明在0.065~1.310 mg.mL-1之間呈良好的線性關(guān)系。

        2.5 最低定量限及檢測限

        采用信噪比法檢測黃芪甲苷的檢測限及定量限。以信噪比為3∶1時相應(yīng)濃度確定其檢測限,以信噪比為10∶1時相應(yīng)濃度確定其定量限。將黃芪甲苷對照品溶液稀釋一定倍數(shù),分別自動進(jìn)樣20 μL,得到黃芪甲苷的檢出限及定量限。檢測限為:0.434 μg。定量限為:1.300 μg。

        2.6 精密度實驗

        精密吸取黃芪甲苷對照品溶液,按“2.1”色譜條件連續(xù)測定6次, 記錄峰面積,測得黃芪甲苷的精密度(RSD)為0.14%,表明精密度良好。

        2.7 重復(fù)性實驗

        精密量取得力生注射液,按“2.2.2”供試品溶液的制備方法制備6份得力生注射液供試品溶液,按“2.1”色譜條件依次測定,記錄色譜峰峰面積,測得黃芪甲苷峰面積的RSD為3.47%(n=6),結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

        2.8 穩(wěn)定性實驗

        分別精密吸取室溫下放置的得力生注射液供試品溶液,分別在配制后0,2,4,6,8和12 h,按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析,測定黃芪甲苷峰面積,計算RSD為3.12%。結(jié)果表明,供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.9 加樣回收率實驗

        精密量取已知含量的得力生注射液50 mL,共9份,按80%,100%,150% 3個目標(biāo)濃度,分別精密加入黃芪甲苷對照品適量,每一質(zhì)量濃度取3份,按“2.2.2”項下制備供試品溶液,按“2.1”色譜條件測定,計算平均回收率為100.1%,RSD為3.7%。結(jié)果見表1。

        表1 回收率實驗結(jié)果 (n=9)

        2.10 樣品測定

        取3批得力生注射液供試品溶液各20 μL,采用“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析,測定黃芪甲苷的含量。結(jié)果表明,3批得力生注射液(批號101101,101102,101103)中黃芪甲苷的含量分別為12.84 μg.mL-1、12.58 μg.mL-1、16.12 μg.mL-1。

        3 討論

        黃芪甲苷為得力生注射液中黃芪扶正祛邪,調(diào)節(jié)機體免疫功能的主要活性成分。本研究建立了該成分含量測定方法,方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高,能夠有效控制該制劑質(zhì)量。

        鑒于黃芪甲苷的紫外最大吸收波長在200 nm ,屬有末端吸收[8],故本研究采用HPLC-ELSD測定黃芪甲苷的含量。通過對蒸發(fā)光檢測器溫度和載氣流量等考察,當(dāng)檢測器溫度100℃;載氣流量:2.7 L.mL-1黃芪皂苷的響應(yīng)值較好,并且有較好的分離度。同時對不同流動相體系甲醇-水、乙腈-水,及不同流動相比例進(jìn)行考察,確定乙腈-水(32∶68)為流動相具有較好的分離度。

        由于得力生注射液由紅參、黃芪、蟾酥和斑蝥四味藥材提取物制成,干擾成分較多。目前尚未見得力生注射液中黃芪甲苷的含量測定方法。本研究對黃芪甲苷的富集方法進(jìn)行優(yōu)化。采用大孔樹脂法、水飽和正丁醇萃取法和SPE固相萃取法分別制備供試品溶液,結(jié)果表明,3種方法測定結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)差異。在獲得較好實驗結(jié)果的前提下,考慮到方法重現(xiàn)性、檢測成本等因素,最終采用大孔吸附樹脂法富集得力生注射液中黃芪甲苷。對大孔樹脂類型和洗脫梯度進(jìn)行考察,確定D101型大孔吸附樹脂柱,以水50 mL洗脫,棄去水液,再用40%乙醇30 mL洗脫,棄去洗脫液,繼用95%乙醇100 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘渣加甲醇溶解。這一前處理方法可有效去除極性成分,糖類等的干擾,實現(xiàn)黃芪甲苷準(zhǔn)確定量。

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