李艷，杜蕾蕾，張小靈，劉川，賴先榮，張藝，范剛

小檗花，藏藥名為“杰唯美多”、“吉嘎爾梅朵”等，收載于《四部醫(yī)典》、《晶珠本草》、《中國藏藥?第三卷》、《中華藏本草》等藏醫(yī)藥著作[1～4]。藏藥小檗花味甘、性涼，具有解毒、止瀉、利濕、干黃水、止血、消炎等功效，常用于治療熱瀉、瘟疫、陳舊熱、出血癥等[1～4]。目前，小檗花藥材的化學(xué)成分及質(zhì)量評價研究報道甚少，僅1991 年Sivakumar等[5]從小檗科小檗屬植物Berberis aristata花中分離得到綠原酸、咖啡酸、槲皮素、蘆丁和臘梅苷等成分，但國內(nèi)外未見這些成分的含量測定和藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究報道。為了提高小檗花藥材的質(zhì)量控制水平，本文根據(jù)《中國藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求，對小檗花藥材進(jìn)行了顯微鑒別、薄層鑒別研究，測定了水分、總灰分、酸不溶性灰分含量，同時采用HPLC法測定了有效成分綠原酸的含量，為其開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

美國Agilent 1200高效液相色譜儀，配備二極管陣列（DAD）檢測器、自動進(jìn)樣器和柱溫箱；DHG-9023A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 (上海一恒科技有限公司)；Sartorius BP121s電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；2.5-12型箱式電阻爐（沈陽市節(jié)能電爐廠）；ULUP-I-10T優(yōu)普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）；CQ-250超聲波清洗器（上海必能信有限公司）。

綠原酸對照品（批號：110781-200512，供含量測定用）購自中國藥品生物制品檢定所，使用前置干燥器中干燥至恒重。乙腈為色譜純（Fisher），水為超純水，其余試劑均為分析純。本文共收集了5批小檗花藥材，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)賈敏如教授鑒定其為小檗科植物金花小檗Berberis wilsonaeHemsl.和刺黃花Berberis polyanthaHemsl.的干燥花及花蕾，藥材來源見表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

取5批小檗花藥材樣品，分別粉碎，照顯微鑒別法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅡC），觀察其粉末的顯微特征。本品粉末黃棕色至棕色?；ǚ哿５S色，呈圓球形、類圓形，直徑40～50 μm，表面有點狀雕紋。萼片表皮細(xì)胞表面觀類多角形或稍不規(guī)則，壁薄，較平直?；ü诒砥ぜ?xì)胞類長圓形或類多角形，垂周壁薄，較平直，含多數(shù)淡黃色物，花冠裂片頂端表皮細(xì)胞外壁突起呈短絨毛狀。柱頭及花柱上部表皮細(xì)胞分化成圓錐形單細(xì)胞毛，先端尖或稍鈍?；ǚ勰覂?nèi)壁細(xì)胞表面觀呈長圓形，具網(wǎng)狀或不規(guī)則螺旋狀增厚。導(dǎo)管為梯紋、螺紋，直徑15～40 μm。見圖1。

圖1 小檗花藥材粉末顯微特征圖

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.2.3 薄層色譜條件及結(jié)果 照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液2 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶1.5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，在105 ℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖2。

圖2 小檗花的TLC圖

2.3 檢查

水分測定按照《中國藥典》2010年版一部附錄IX H第一法測定，總灰分、酸不溶性灰分按照《中國藥典》2010年版一部附錄IX K方法測定，結(jié)果見表2。

2.4 綠原酸的HPLC含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 × 4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），檢測波長：327 nm，流速：1.0 mL．min-1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于5000。

2.4.2 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含90 μg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 線性關(guān)系的考察 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.40 mg的對照品貯備溶液。分別精密吸取對照品貯備溶液1.35，1.80，2.25，3.75，7.50，15.00 mL至不同的10 mL量瓶中，加甲醇制成不同濃度的綠原酸對照品溶液。精密吸取綠原酸對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以綠原酸峰面積值為縱坐標(biāo)，濃度（mg．mL-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y = 32912 X - 110.83（r = 0.9999），綠原酸在0.054～0.600 mg．mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取綠原酸對照品溶液（0.09 mg．mL-1）10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.18%，表明精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取綠原酸對照品溶液（0.09 mg．mL-1）各10 μL，于0，1，2，4，12，24 h分別注入高效液相色譜儀測定，記錄峰面積，其RSD為0.13%，表明對照品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（批號：2013071702）粉末約0.2 g，共6份，精密稱定，按上述供試品溶液制備方法分別制備供試品溶液。在上述色譜條件下，依法測定，計算綠原酸的含量。結(jié)果，本批藥材中綠原酸的平均含量為0.45%，RSD為1.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取同一批（批號：2013071702）已知含量的小檗花樣品粉末9份，每份約0.1 g，精密稱定，分別按已知含量的80%，100%，120%三個水平加入綠原酸對照品，再按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定綠原酸的含量，計算回收率，見表1。結(jié)果綠原酸的加樣回收率在95～105%之間，平均回收率為98.75%，RSD為1.22%。

表1 綠原酸加樣回收率試驗結(jié)果

2.4.9 樣品含量測定 取不同批次的小檗花藥材樣品，平行2份，按供試品溶液制備項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定綠原酸的含量。對照品及供試品的HPLC圖譜見圖3，含量測定結(jié)果見表2。

圖3 對照品（A）和供試品（B）的HPLC圖譜（1.綠原酸）

表2 小檗花藥材檢查項及綠原酸含量測定結(jié)果（n = 2）

從表2可知，5批藥材中綠原酸的含量在0.44%～2.64%之間，不同品種的小檗花藥材綠原酸含量差異較大，金花小檗的綠原酸含量平均值為0.60%，刺黃花的綠原酸含量平均值為2.52%，不同的植物物種由于遺傳背景差異而影響了化學(xué)成分的合成與積累。課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，藏醫(yī)臨床所使用的小檗花藥材的“基源”十分混亂，小檗屬多個品種均可入藥。根據(jù)本文的研究結(jié)果，今后應(yīng)密切注意不同品種小檗花藥材的療效差異。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

小檗花主要含有酚酸（綠原酸、咖啡酸）及黃酮類（槲皮素、蘆丁、臘梅苷）成分[5]，本實驗采用HPLC-DAD法，通過對照品對照，并比對紫外吸收圖譜，發(fā)現(xiàn)小檗花藥材中含有較高含量的綠原酸，而咖啡酸、蘆丁、槲皮素等成分含量甚微?，F(xiàn)代研究表明，綠原酸具有明顯的抗菌、抗病毒作用，并能縮短凝血及出血時間[6～8]，這與藏醫(yī)用小檗花治療瀉痢、失血等癥相吻合。因此，本文選擇綠原酸作為小檗花藥材的薄層鑒別及含量測定的指標(biāo)性成分是合理的。

3.2 薄層鑒別條件的考察

本文考察了乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶1.5）、乙酸乙酯-甲酸-乙醇（7∶2∶1）、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）等溶劑系統(tǒng)，結(jié)果乙酸丁酯-甲酸-水溶劑系統(tǒng)展開效果最佳?？疾炝斯┰嚻啡芤翰煌狞c樣量（1, 2, 3, 5 μL），結(jié)果發(fā)現(xiàn)點樣量為2 μL時，綠原酸斑點圓整、清晰。另外，本文還考察了不同薄層板、溫度、濕度等條件對薄層展開的影響程度，結(jié)果不同的薄層板、溫度和濕度對展開結(jié)果沒有影響，綠原酸均能得到很好的分離，說明建立的薄層鑒別方法的耐用性較好。

3.3 綠原酸HPLC含量測定條件的考察

目前，小檗花中綠原酸的HPLC含量測定未見報道，本文參考《中國藥典》2010版一部“金銀花”、“杜仲葉”藥材中綠原酸HPLC含量測定方法，通過大量實驗，確定了最佳的HPLC色譜條件。在供試品溶液制備時，考察了甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、50%乙醇溶劑的提取效率，結(jié)果70%甲醇的提取效果最佳；考察了超聲、冷浸、水浴回流3種不同提取方法，結(jié)果超聲提取比回流、冷浸提取的效率更高。此外，本文還對超聲時間、提取次數(shù)、溶劑用量等參數(shù)進(jìn)行了單因素考察，最終確定了最優(yōu)的供試品溶液制備方法。

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