齊春玲，付彩霞

（1.濟(jì)南市第七中學(xué)化學(xué)組，山東濟(jì)南 250013； 2.濱州醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，山東煙臺 264003）

葉酸與氨基酸相互作用的熒光光譜

齊春玲1，付彩霞2＊

（1.濟(jì)南市第七中學(xué)化學(xué)組，山東濟(jì)南 250013； 2.濱州醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，山東煙臺 264003）

在模擬動物生理?xiàng)l件下，利用熒光光譜法在分子水平上研究了葉酸同色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的相互作用；根據(jù)雙對數(shù)方程求出了不同溫度下兩者反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù).結(jié)果表明：葉酸能導(dǎo)致氨基酸的熒光猝滅，三種氨基酸的猝滅機(jī)制均為靜態(tài)猝滅；從相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)可知，色氨酸和酪氨酸與葉酸之間的主要作用力為疏水作用力，而苯丙氨酸與葉酸之間的主要作用力為氫鍵和范德華力.

葉酸；氨基酸；相互作用；熒光光譜

氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)并同生命活動有關(guān)的最基本的物質(zhì)，如果人體缺乏任何一種必需氨基酸就可導(dǎo)致生理功能異常，影響抗體代謝的正常進(jìn)行，最后導(dǎo)致疾病.酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸是三種含苯環(huán)的芳香族氨基酸，是蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的來源，蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的變化也依賴于這些熒光基團(tuán)性質(zhì)的改變，因此研究芳香族氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)、反應(yīng)特性和生物活性具有重要意義.

葉酸（FA）是一種水溶性維生素，因?yàn)樽畛跏菑牟げ巳~子中分離提取出來的，故得名“葉酸”.葉酸與DNA的合成密切相關(guān)，葉酸缺乏時，細(xì)胞內(nèi)DNA合成減少，細(xì)胞的分裂成熟發(fā)生障礙，引起巨幼紅細(xì)胞性貧血［1］.小腸疾病能干擾食物葉酸的吸收和經(jīng)肝腸循環(huán)的再循環(huán)過程，故葉酸缺乏是小腸疾病常見的一種并發(fā)癥 .有關(guān)葉酸與BSA及金屬離子的相互作用已有報(bào)道 ，但葉酸與氨基酸相互作用的研究未見報(bào)道，因此本文作者采用熒光光譜法，在生理?xiàng)l件下研究了葉酸與色氨酸（tryptophan，Try）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）及苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）的相互作用，獲得了一些有價(jià)值的信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LS－55型熒光分光光度計(jì)（美國Perkin EImer公司）；pH－3C酸度計(jì)（上海逸龍科技有限公司）；AR1140型電子分析天平（OhausCorp.PineBrook，NJ，USA）；電熱恒溫水浴鍋（龍口市先科儀器公司）；KQ－500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）.

葉酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；色氨酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；酪氨酸（天津市博迪化工有限公司）；苯丙氨酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）.

葉酸用0.5%氨水溶液溶解，用二次蒸餾水配制成濃度為1.00×10－4mol·L－1的溶液；用0.1mol· L－1，pH＝7.40的Tris－HC1（內(nèi)含0.10mol·L－1的NaCl溶液以維持離子強(qiáng)度）緩沖溶液分別配制濃度為1.00×10－4mol·L－1的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸溶液；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，經(jīng)檢測均無熒光雜質(zhì)，其他試劑均為分析純.以上溶劑均放入冰箱，在4℃避光保存.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別取3mL三種氨基酸溶液加入石英比色皿中，依次加入10μL葉酸溶液（加入體積＜100μL，忽略體積對濃度的影響），搖勻，靜置5min，分別在21，37℃下掃描熒光光譜，Try、Tyr和Phe的激發(fā)波長分別為276、272和261nm，在280～550nm范圍內(nèi)記錄熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 FA與氨基酸的相互作用

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸能產(chǎn)生熒光.當(dāng)激發(fā)波長為276nm、272nm和261nm時，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的熒光峰位分別于358nm、306nm和291nm附近.由圖1可見，F(xiàn)A在氨基酸熒光發(fā)射峰附近無熒光發(fā)射峰，隨著FA濃度的增加，氨基酸的峰位置及峰形基本保持不變，但氨基酸的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，說明FA對氨基酸的熒光有猝滅現(xiàn)象，F(xiàn)A與氨基酸之間存在相互作用.此外，同一條件下苯丙氨酸熒光強(qiáng)度明顯低于酪氨酸和色氨酸，這與白蛋白具有的熒光強(qiáng)度主要來自于色氨酸殘基和酪氨酸殘基［5］相一致.

圖1 21℃下葉酸對氨基酸的熒光猝滅光譜Fig.1 The fluorescence quenching spectra of BSA in the presence of aminoacid at 21℃

2.2 FA與氨基酸作用的熒光猝滅方式

引起氨基酸熒光猝滅的原因可能有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，前者是一種能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過程，不影響氨基酸的結(jié)構(gòu)和生理活性，遵循Stern－Volmer方程；后者則是由于發(fā)生了配合作用，通常是產(chǎn)生了不發(fā)熒光的配合物，可影響其生理活性.熒光猝滅符合下列關(guān)系式：

式中F0為未加入FA時的氨基酸熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為FA濃度等于cFA時的熒光強(qiáng)度，KSV為猝滅常數(shù)，Kq為動態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為猝滅劑不存在時熒光物質(zhì)的平均壽命（Try、Tyr和Phe的熒光壽命分別為3.1×10－9，3.6× 10 和6.8×10s ）.各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散速率常數(shù)為2.0×10L·mol·s ，如果所求得的Kq值遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol－1·s－1，則此猝滅過程為靜態(tài)猝滅過程；反之，則為動態(tài)猝滅.由式（1）作出21，37℃下，葉酸對氨基酸熒光猝滅的Stem－Volmer曲線（見圖2）.

圖2 FA和氨基酸相互作用的Stern－Volmer曲線Fig.2 Stern－Volmer plots of the interaction between FA and aminoacid

由直線的斜率可求出21和37℃下，KSV、Kq和線性回歸系數(shù)R值（見表1）.由表1得出葉酸與三種氨基酸的線性擬合程度很高，Kq值均在1013L·mol－1·s－1數(shù)量級以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2×1010L·mol－1·s－1，表明葉酸對氨基酸的猝滅過程不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動態(tài)猝滅，而是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程［8］.從表1還可以看出，溫度對KSV的影響不大，說明溫度對氨基酸與葉酸結(jié)合的影響較小.

表1 FA與氨基酸相互作用的Stern－Volmer常數(shù)和相關(guān)系數(shù)Table 1 Stern－Volmer constants and correlation cocefficients of FA with aminoacids

2.3 FA與氨基酸的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

根據(jù)關(guān)系式（2），分別在21、37℃下作lg［（F0－F）／F］對lgc的雙對數(shù)圖，由截距和斜率求得不同溫度的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n（見表2）.

式中KA為葉酸與氨基酸的結(jié)合常數(shù)，n為葉酸與氨基酸結(jié)合位點(diǎn)數(shù).

表2 FA與氨基酸相互作用的相關(guān)參數(shù)Table 2 Related parameters for FA binding with aminoacids

由表2可以看出，由于氨基酸與FA的結(jié)合常數(shù)具有較大的數(shù)值，故氨基酸和FA間存在較強(qiáng)的相互作用，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n都近似等于1.

2.4 FA和氨基酸的主要作用力類型

藥物小分子和生物大分子之間的作用力主要有氫鍵、靜電作用、范德華力、疏水力［9－10］.根據(jù)熱力學(xué)公式：

由不同溫度下的結(jié)合常數(shù)，求得ΔH、ΔS、ΔG，列于表1中.根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷FA與氨基酸之間的主要作用力類型［11］：ΔH＞0、ΔS＞0主要為疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0主要為氫鍵和范德華力；ΔH＜0、ΔS＞0主要為靜電引力.從表1可以看出，F(xiàn)A與氨基酸的相互作用是自發(fā)的（ΔG＜0）.由苯丙氨酸的ΔH＜0及ΔS＜0的事實(shí)推斷，F(xiàn)A與Phe之間的作用力主要是氫鍵和范德華力；而由色氨酸和酪氨酸的ΔH＞0、ΔS＞0的事實(shí)推斷，F(xiàn)A與Try、Tyr之間的作用力主要為疏水作用力.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用熒光光譜法證明了氨基酸與葉酸共存時能夠發(fā)生相互作用.結(jié)果表明，F(xiàn)A對氨基酸產(chǎn)生了較強(qiáng)的熒光猝滅作用，并且色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸與FA作用的猝滅均屬于靜態(tài)猝滅.求得了氨基酸與FA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)參數(shù).熱力學(xué)數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)A與Phe之間的作用力主要是氫鍵和范德華力；而FA與Try，F(xiàn)A與Tyr之間的作用力主要為疏水作用力.這些研究結(jié)果將有助于了解FA在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況，對于闡明FA的藥物作用機(jī)制具有一定的參考價(jià)值.

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Interaction of folie acid and amino acids by fluorescence spectrometry

QI Chunling1，F(xiàn)U Caixia2＊
（1.ChemistryGroup，JinanSeventhMiddleSchool，Jinan250013，Shandong，China；2.ChemistryStaffRoom，BinzhouMedicalCollege，Yantai264003，Shandong，China）

The interactions between folie acid and amino acids including thetryptophan，tyrosine，phenylalanine were investigated by fluorescence spectroscopy under simulated physiological condition of animal body；and the binding constants and the number of binding sites were calculated with double logarithmic equation.Results show that folie acid is able to quench the fluorescence intensity of the amino acids；and the quenching of the three amino acids by folie acid is a static quenching process.Relevant thermodynamic parameters demonstrate that hydrophobic force plays a major role in the binding of folie acid with tryptophan and tyrosine，while both hydrogen bond and Van der Waals force play a major role in the binding of folie acid with phenylalanine.

folie acid；amino acid；interaction；fluorescence spectrometry

O 655

A

1008－1011（2014）02－0148－04

2013－12－06.

山東省教育廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（J08LG15）.

齊春玲（1965－），女，中學(xué)高級教師，主要從事中學(xué)化學(xué)教學(xué)和光化學(xué)分析研究.＊

，E－mail：fcx6309＠163.com.