張燕菊，劉智敏，許志剛

（昆明理工大學(xué)理學(xué)院，云南昆明 650500）

用高效液相色譜法測(cè)定燈盞花中槲皮素的含量

張燕菊，劉智敏，許志剛＊

（昆明理工大學(xué)理學(xué)院，云南昆明 650500）

分別采用溶劑回流提取和超聲提取兩種方法對(duì)燈盞花樣品中的槲皮素進(jìn)行提取，優(yōu)化了提取條件，并用高效液相色譜進(jìn)行了定量分析，采用掃描電鏡分析了提取樣品的表面形貌.結(jié)果表明：兩種方法的提取率分別為0.048 7mg／g和0.042 3mg／g，溶劑回流的提取效果略?xún)?yōu)于超聲提取；回流提取時(shí)的高溫有利于提取物的溶出，而超聲提取節(jié)能、快速.與此同時(shí)，采用兩種方法提取的樣品表面都受到明顯的侵蝕，且回流提取時(shí)的機(jī)械攪拌促進(jìn)樣品的破碎，這些都有利于槲皮素的溶出.

燈盞花；槲皮素；提?。桓咝б合嗌V；測(cè)定

槲皮素是一種存在于水果、蔬菜和中草藥等植物中的植源性黃酮類(lèi)化合物，尤其在茶葉［1－2］、洋蔥［3］、山楂［4］中含量較高.槲皮素具有抗氧化性和清除自由基的作用，能抗癌、消炎、祛痰、止咳、平喘、降血壓、降血脂［5］.燈盞花是云南的特色中草藥之一，有重要的藥用價(jià)值，其主要成分有燈盞花乙素、燈盞花甲素和槲皮素等黃酮類(lèi)化合物.目前，有關(guān)燈盞花中燈盞花素的研究報(bào)道較多［6－7］，而有關(guān)燈盞花中槲皮素的研究報(bào)道較少.黃洪波等人 首次從燈盞花中分離提取到槲皮素，李菁等人 也從燈盞花中首次分離出槲皮素－3－O－β－D－葡萄糖苷，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定.然而，目前還沒(méi)有文獻(xiàn)定量報(bào)道燈盞花中槲皮素的含量.本文作者采用溶劑回流和超聲提取兩種方法提取燈盞花中的槲皮素，優(yōu)化了提取條件，并用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，為燈盞花中黃酮類(lèi)化合物的有效利用提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司），C18色譜柱（J＆K Scientific LTD，5 μm，4.6mm×250.0mm），F(xiàn)EI Quanta 200掃描電子顯微鏡（荷蘭FEI公司），PS－20超聲波清洗機(jī)（東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司），N－1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），SC－04型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），HH－S數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市華城開(kāi)元實(shí)驗(yàn)儀器廠），F(xiàn)A2004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）.

主要試劑：燈盞花購(gòu)于昆明市菊花村中藥市場(chǎng)（2012－03－07，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館鑒定），槲皮素購(gòu)于陜西森弗高科實(shí)業(yè)有限公司（98%），乙腈為色譜級(jí)（西隴化工股份有限公司），其他試劑均為分析純，水為超純水，使用前經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將燈盞花全草樣品破碎，過(guò)200目篩.稱(chēng)取樣品1.0g加入50mL圓底燒瓶中，加入一定量的溶液，分別采用超聲提取和溶劑回流提取.提取完成后進(jìn)行抽濾，濾渣重復(fù)提取一次，合并濾液并減壓蒸除大部分溶劑，濃縮液在3 500r／min的速度下離心分離10min，提取液轉(zhuǎn)入梨形漏斗中，用15mL的乙酸乙酯萃取兩次，收集乙酸乙酯萃取液并濃縮至干，用乙醇提取液定容至10mL，高效液相色譜分析前經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾.

1.3 色譜條件

流動(dòng)相為乙腈－0.2%磷酸溶液，體積比為30∶70，流速為1.0mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣體積均為20μL，采用外標(biāo)法定量.

2 結(jié)果與討論

2.1 槲皮素的高效液相色譜分析

分別配制槲皮素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度依次為0.05、0.5、1.00、2.50、5.00、10.00mg／L）進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖1所示繪制峰面積－濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性方程為Y＝－0.229＋0.929X，相關(guān)系數(shù)R＝0.999 2.

圖1 1mg／L槲皮素的色譜分析圖Fig.1 Chromatograph of 1mg／L quercetin standard solution

2.2 燈盞花中槲皮素的提取方法優(yōu)化

分別采用溶劑回流提取法和超聲提取法對(duì)燈盞花樣品中的槲皮素進(jìn)行提取，對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間和固液比進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合色譜分析結(jié)果比較兩種提取方法的效率.

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

稱(chēng)取燈盞花樣品1.0g若干份，采用不同濃度的溶液各15mL作為提取溶劑，分別進(jìn)行沸水浴提取和室溫超聲提取，前者提取時(shí)間為60min，后者為15min，其余操作按1.2進(jìn)行，用相應(yīng)的提取液定容至10.00 mL，然后進(jìn)行HPLC分析，分析結(jié)果如圖2所示.槲皮素的提取率定義為1.0g樣品中提取到的槲皮素的總量.結(jié)果表明，乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)）為70%時(shí)，溶劑回流提取法的提取率最高，而乙醇濃度為50%時(shí)，超聲提取的效率最高.優(yōu)化結(jié)果也表明：提取方法不同，最優(yōu)的提取溶劑也不相同.

圖2 不同濃度乙醇提取液對(duì)槲皮素提取率的影響Fig.2 Effect of different concentration ethanol extraction solution on extraction ratio of quercetin

2.2.2 提取時(shí)間的優(yōu)化

稱(chēng)取兩份樣品各1.0g，分別采用70%和50%的乙醇水溶液進(jìn)行溶劑回流提取和超聲提取時(shí)間的優(yōu)化，前者分別考察30、45、60、75、90min，后者分別考察10、15、20、25、30min，分析結(jié)果如圖3所示.結(jié)果表明，溶劑回流的提取時(shí)間對(duì)提取率的影響較大，提取時(shí)間為60min時(shí)提取率最高；而超聲提取時(shí)間在10～30 min內(nèi)，提取率基本不變，因此，兩種方法的提取時(shí)間分別選擇60min和15min.

圖3 提取時(shí)間對(duì)槲皮素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction ratio of quercetin

2.2.3 固液比的優(yōu)化

稱(chēng)取樣品1.0g若干份，兩種提取方法的固液比分別考察1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，分析結(jié)果如圖4所示.固液比對(duì)溶劑回流法提取槲皮素的影響略有起伏，同時(shí)考慮到提取效率和溶劑用量的因素，選擇最優(yōu)固液比為1∶15；而對(duì)于超聲提取，固液比為1∶20時(shí)，提取量趨于平衡，選擇最優(yōu)固液比為1∶20.

2.3 燈盞花樣品中槲皮素的含量測(cè)定

分別采用溶劑回流提取和超聲提取方法，在各自最優(yōu)的提取條件下對(duì)燈盞花樣品中的槲皮素進(jìn)行提取，并用高效液相色譜進(jìn)行定量分析（見(jiàn)圖5），計(jì)算樣品中提取出的槲皮素含量.分析結(jié)果表明，溶劑回流提取法燈盞花樣品中的槲皮素提取率為0.048 7mg／g（RSD＝5.7%，n＝5），超聲提取法的提取率為0.042 3 mg／g（RSD＝3.3%，n＝5），略低于前者，但后者耗時(shí)短.溶劑回流提取的效果優(yōu)于超聲提取的原因可能與提取的溫度有關(guān)，高溫加速了槲皮素的溶出，此外，磁力攪拌子的機(jī)械攪拌可能會(huì)進(jìn)一步破碎樣品.

2.4 燈盞花樣品提取前后的掃描電鏡圖分析

對(duì)兩種不同提取方法提取后的燈盞花樣品與未經(jīng)處理的燈盞花樣品進(jìn)行了掃描電鏡對(duì)比分析，放大1 000倍的電鏡圖如圖6所示.超聲提取后的樣品表面結(jié)構(gòu)明顯遭到破壞，并形成較多孔洞和坑洼，這可能是超聲作用引起樣品表面結(jié)構(gòu)的破壞，但這對(duì)分析物的溶出是有利的，從而使提取率提高；溶劑回流提取后的樣品表面結(jié)構(gòu)同樣受到嚴(yán)重破壞，這可能是由于攪拌產(chǎn)生的機(jī)械作用造成的.此外，沸水浴也加快了溶質(zhì)的溶出，因此沸水浴回流提取取得了更好的提取效果.

圖4 固液比對(duì)槲皮素提取率的影響Fig.4 Effect of solid－liquid ratio on extraction ratio of quercetin

圖5 燈盞花中槲皮素的色譜分析圖Fig.5 Chromatograph of quercetin in ErigeronBreviscapus

圖6 燈盞花樣品萃取前后的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of ErigeronBreviscapus

3 結(jié)論

分別采用溶劑回流提取和超聲提取兩種方法對(duì)燈盞花中的槲皮素黃酮化合物進(jìn)行了提取，對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并用高效液相色譜進(jìn)行定量分析.兩種提取方法的對(duì)比分析表明，溶劑回流提取的效果略?xún)?yōu)于超聲提取.這可能是由于高溫加速了槲皮素的溶出且磁力攪拌進(jìn)一步破碎了樣品，有利于槲皮素的快速溶出.因此，在提取燈盞花中的槲皮素時(shí)應(yīng)盡量減小樣品的尺寸并提高萃取的溫度.

［1］許志剛，陳云麗，張仙麗，等.超聲波提?。咝б合嗌V法測(cè)定茶葉中的槲皮素［J］.昆明學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35（3）：66－68.

［2］劉 波，張浩科，宮海燕.反相高效液相色譜法測(cè)定新疆枸杞葉茶中蘆丁和槲皮素的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（14）：92－94.

［3］陳代武，李杰紅.微波輔助萃?。璈PLC測(cè)定洋蔥槲皮素技術(shù)的研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，27（1）：101－106.

［4］王珍，李秀霞，李嬌，等.高效液相色譜法測(cè)定山楂中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（9）：302－305.

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［7］許志剛，劉智敏，楊保民，等.燈盞花中燈盞花乙素的提取與分析方法探討［J］.昆明學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33（6）：81－84.

［8］黃洪波，包文芳，楊芳芳，等.燈盞花的化學(xué)成分研究［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，18（4）：266－267.

［9］李菁，于德泉.燈盞花化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36（11）：1458－1462.

Determination of quercetin inErigeronBreviscapusby high performance liquid chromatography

ZHANG Yanju，LIU Zhimin，XU Zhigang＊
（FacultyofScience，KunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650500，Yunnan，China）

Quercetin was extracted fromErigeronBreviscapusby solvent reflux extraction method and ultrasonic extraction method，respectively，and relevant extraction conditions were optimized.The extracted samples of quercetin were quantitatively analyzed by high performance liquid chromatography，and their morphology was observed with a scanning electron microscope.Results show that the extraction efficiency of the two methods is 0.048 7mg／g and 0.042 3mg／g，respectively，and the solvent reflux extraction method exhibits slightly better extraction efficiency than ultrasonic extraction method.Besides，elevating temperature of solvent reflux extraction method helps to promote the extraction of quercetin，and ultrasonic extraction method has advantages of energy－saving and fast determination.In the meantime，the surfaces of the quercetin samples extracted by the two methods are both apparently eroded and mechanical agitation of solvent reflux extraction enhances the breakage of the extracted samples，thereby favoring the extraction of quercetin.

ErigeronBreviscapus；quercetin；extraction；high performance liquid chromatography；determination

O 657.7

A

1008－1011（2014）02－0140－04

2013－12－02.

國(guó)家自然科學(xué)基金（21205054），云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2011FZ043），昆明理工大學(xué)分析測(cè)試基金（20130568，20130562）.

張燕菊（1991－），女，本科生，從事色譜分析.＊

，E－mail：chemxuzg＠kmust.edu.cn.