周 玥，楊秀華，郭 華

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

菜籽粕是油菜籽提油后的主要副產(chǎn)品之一，分為普通菜籽粕和雙低菜籽粕。菜籽粕中含有菜籽蛋白、菜籽多酚、植酸、菜籽多糖等多種成分[1]。這些成分都具有較高的利用價值。菜籽粕中含硫氨基酸如蛋氨酸、胱氨酸和組氨酸的含量較高，且含有豐富的硒和磷[2]；但蛋白質(zhì)含量稍低，粗纖維含量較高，同時含有一些抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)如硫甙、單寧、植酸、芥子堿等。

普通菜籽粕中硫甙含量較高（大于30 moL/g）。硫甙本身無毒，易溶于水，但在芥子酶的作用下很容易分解成異硫氰酸酯、噁唑烷硫酮及腈類等有毒物質(zhì)。單寧可抑制消化酶的活性而降低蛋白質(zhì)的利用率；植酸是一種很強的金屬螯合劑，可降低礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、淀粉和脂質(zhì)的消化利用率和單胃動物磷的利用率[3]；這些都是限制優(yōu)質(zhì)菜籽蛋白合理利用的主要因素[4]。由于上述原因，大部分菜籽粕/餅被直接當(dāng)作肥料使用，造成了天然植物蛋白資源的極大浪費。

雙低菜籽指的是油菜種子中硫代葡萄糖甙含量低，而脂肪酸組成中芥酸含量低的菜籽品種[5]。對雙低油菜籽進(jìn)行水酶法提油后發(fā)現(xiàn)，硫苷、植酸、芥子堿、丹寧等營養(yǎng)抑制物主要存在在菜籽皮中，而脫皮是水酶法提油工藝中的一道關(guān)鍵工序[6-8]，故水酶法提油后的菜籽粕中幾乎不含硫甙、植酸、丹寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子，這為雙低菜籽粕作為植物蛋白在食品加工中的應(yīng)用提供了一個必要的前提條件。鑒于菜籽粕含有較高的蛋白質(zhì)，如能開發(fā)成食品或食品加工原料，將極大地提高菜籽餅/粕的附加值。因此，試驗以雙低菜籽粕為材料，通過水酶法提油，進(jìn)行發(fā)酵發(fā)酵來制備醬油，并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試雙低菜籽粕是由2011年收獲的油菜籽（購自湖南省常德市）制得；供試的發(fā)酵菌種有米曲霉（Aspergillus oryzae）1~6、黑曲霉（Aspergillus niger）1~4和木霉（Trichoderma viridi）（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實驗室）。

試驗主要試劑：氫氧化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、二氯甲烷、無水乙醚、石油醚（沸程30-60℃），甲醛、三氯乙酸和酪素等，均為分析純。

試驗主要儀器：A U Y 2 2 0型分析天平（SHIMADZU公司），722s型分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）， SHZ- 82A型水浴恒溫振蕩器（上海比朗儀器有限公司），TP-3000E電子天平（上海穗康儀器有限公司），pHS-3E pH計（上海雷磁儀器廠），101A-SET電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司），2XJ-IIB低速大容量多管離心器（上海本昂科學(xué)儀器有限公司），旋風(fēng)分離機（東莞市重源塑料機械有限公司），LDZX-75KBS型立式高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療機械廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜籽粕安全性評價 經(jīng)水酶法提油后，菜籽粕中可能還會有少量硫甙殘留，若用此種菜籽粕制造醬油的話，有必要對其安全性進(jìn)行評估，試驗采用按硫脲紫外法[9]對提油后的菜籽粕進(jìn)行異硫氰酸酯和嗯唑烷硫酮的測定。

1.2.2 菌種篩選 以雙低菜籽粕為原料，拌入40%麩皮，分別接種米曲霉1、米曲霉2、米曲霉3、米曲霉4、米曲霉5、米曲霉6，黑曲霉1、黑曲霉2、黑曲霉3、黑曲霉4，于28℃、95%濕度下培養(yǎng)3d左右，至孢子成熟為止，用福林酚法[10]分別測定其蛋白酶活力，選擇蛋白酶活最佳的菌種作為發(fā)酵菌種。

1.2.3 接種量 以雙低菜籽粕為原料，分別接種由試驗1.2.2篩選出的菌種，接種量分別為3%、5%、7%、9%，于28℃、95%濕度下培養(yǎng)3 d左右，至孢子成熟為止，分別測定蛋白酶的活力，以選取較佳接種量。

1.2.4 配料比 探索菜籽粕與麩皮的配料比，以最大限度利用菜籽粕為原則[11]，試驗中菜籽粕與麩皮的重量比分別為5︰5、6︰4、7︰3、8︰2，9︰1，以低鹽固態(tài)方法發(fā)酵后，按GB 18186-2000的標(biāo)準(zhǔn)對發(fā)酵液的主要指標(biāo)進(jìn)行檢測。

1.2.5 單菌種發(fā)酵 以米曲霉1號與黑曲霉1號為發(fā)酵菌種，于28℃、95%濕度下培養(yǎng)制曲，加入15%鹽水，于42℃后發(fā)酵1個月。按GB 18186-2000的標(biāo)準(zhǔn)分別對發(fā)酵液的氨態(tài)氮、酸度、色率、銨鹽等指標(biāo)進(jìn)行檢測。

1.2.6 復(fù)合菌種發(fā)酵 由于木霉（Trichoderma viride）可產(chǎn)生纖維素酶與果膠酶，加速細(xì)胞壁的崩解[12]， 故以米曲霉1︰黑曲霉1︰木霉比例分別為1︰1︰1、2︰2︰1、3︰2︰1、4︰2︰1、2︰3︰1，總接種量5%，菜籽粕和麩皮按7︰3的比例混合發(fā)酵，于28℃、95%濕度下培養(yǎng)制曲，加入15%鹽水，于42℃后發(fā)酵20 d。按GB 18186-2000的標(biāo)準(zhǔn)分別對發(fā)酵液的氨態(tài)氮、酸度、色率指標(biāo)進(jìn)行檢測。

1.2.7 發(fā)酵液的感官評定 按GB 18186-2000的感官特性要求對發(fā)酵液進(jìn)行感官評定，具體評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards for high salt diluted state ferm entation of soy sauce

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽粕安全性評價

利用三波長分光光度法檢測菜籽粕中硫甙含量，發(fā)現(xiàn)未檢出硫甙；但未經(jīng)提油處理的整籽、菜籽皮、菜籽仁中卻能檢測到硫甙。這說明在提油過程中芥子酶已被充分滅活，硫甙未被分解；或是因為在油脂提取過程中，硫甙已進(jìn)入水相，殘渣中的含量微乎其微，且不會分解產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)。

2.2 菌種篩選

以菜籽粕為培養(yǎng)基，按照1.2.2方法培養(yǎng)并測定蛋白酶活。由表2可知，米曲霉菌種中米曲霉1的蛋白酶活最高，達(dá)到14 811.26 U/g干基，說明米曲霉1最適合在菜籽粕中生長，故可選擇其為醬油發(fā)酵菌種進(jìn)行后續(xù)試驗。黑曲霉菌種中以黑曲霉1的蛋白酶活最高，達(dá)到8 365.31 U/g干基，說明黑曲霉1也適合在菜籽粕中生長，可以作為輔助菌種。

表2 米曲霉和黑曲霉菌種的蛋白酶活力Table 2 The protease activity of Aspergillus oryzae and Aspergillus niger

2.3 最佳接種量

以菜籽粕為培養(yǎng)基，按1.2.3方法培養(yǎng)后，用福林酚法測定蛋白酶活。結(jié)果顯示：當(dāng)米曲霉1接種量為3%、5%、7%和9%時，蛋白酶活分別為10 727.46、12 146.03、12 216.58和12 221.73 U/g干基。因為，當(dāng)接種量為5%時，其蛋白酶活已接近最大值，故在后續(xù)試驗中，均以5%的接種量進(jìn)行發(fā)酵。

影響米曲霉蛋白酶活的主要因素有：（1）霉菌生長情況，霉菌長勢越好，產(chǎn)酶也會越多，物料越蓬松越有利于霉菌的生長；（2）接種量，接種量大，在同等條件下霉菌的菌落越多，產(chǎn)生的酶活效應(yīng)也越高；（3）產(chǎn)孢子量，米曲酶產(chǎn)孢子時酶的活性最強。因此，在制曲過程中還應(yīng)注意控制培養(yǎng)的溫度及物料水分的含量。

2.4 最適配料比

由表3可知，菜籽粕與麩皮添加量為7︰3時，拌出的物料較蓬松，米曲霉在物料內(nèi)外生長均勻，麩皮添加量低于30%時，拌出的物料極易成團，不利于霉菌的生長。麩皮添加量高于30%時，雖然拌出的物料很蓬松，有利于霉菌的充分生長，蛋白酶活力也相對較高，但麩皮的成本要顯著高于菜籽粕，考慮到經(jīng)濟效益選擇菜籽粕與麩皮的最是配比為7︰3。

2.5 單菌種發(fā)酵和復(fù)合菌種發(fā)酵的效果

單菌種發(fā)酵試驗結(jié)果表明，米曲霉1號在菜籽粕中生長良好，蛋白酶活也比黑曲霉高，但水解蛋白的能力有限，以至于氨態(tài)氮含量達(dá)不到三級醬油的標(biāo)準(zhǔn)，這說明單菌種發(fā)酵仍存在一定的不足。

表3 配料比對米曲霉生長的影響Tab le 3 Infl uence of ingredient ratio on the grow th of Aspergillus oryzae

復(fù)合菌種發(fā)酵試驗結(jié)果表明，復(fù)合菌種發(fā)酵制備的醬油均呈淺紅褐色，具甜味，醬香味濃，味鮮美，但較咸，基本達(dá)到高鹽稀態(tài)發(fā)酵二級醬油標(biāo)準(zhǔn)。其中以米曲霉1︰黑曲霉1︰木霉=3︰2︰1的比例復(fù)合發(fā)酵制備的醬油氨態(tài)氮含量較高，色澤較深，進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)配即可達(dá)到一級或以上標(biāo)準(zhǔn)。

由表4可知，復(fù)合菌種的發(fā)酵效果明顯優(yōu)于單菌種發(fā)酵，原因是米曲霉主要產(chǎn)生中性蛋白酶、堿性蛋白酶與淀粉酶，黑曲霉主要產(chǎn)酸性蛋白酶、淀粉酶與果膠酶，而木霉則產(chǎn)生較多的纖維素酶，在適當(dāng)條件下復(fù)合菌種發(fā)酵可以優(yōu)勢互補，充分利用發(fā)酵原料[13]。例如木霉可降解纖維素，破壞油菜籽的細(xì)胞壁，使蛋白質(zhì)暴露更充分；黑曲霉除了分解蛋白質(zhì)外，還可將多糖轉(zhuǎn)化為寡糖與單糖，為自身與米曲霉提供更多的碳源。

表4 單菌種發(fā)酵和復(fù)合菌種發(fā)酵的效果Tab le 4 The resu lts of single strain fermentation and m ixing strains fermentation

3 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，利用雙低菜籽粕為原料釀造醬油具有一定的可行性，無安全隱患；以米曲霉1、黑曲霉1和木霉（3︰2︰1）為復(fù)合菌種，在28℃、95%濕度下培養(yǎng)制曲，再加入15%鹽水，于42℃條件下后發(fā)酵20 d，所制備的醬油呈淺紅褐色，具甜味，醬香味濃，味鮮美，基本達(dá)到GB 18186-2000規(guī)定的二級標(biāo)準(zhǔn)。

單菌種發(fā)酵試驗結(jié)果表明，米曲霉1號在水酶法提油后所得菜籽粕中生長較好，酶活較高，但單菌種發(fā)酵制備的醬油，其品質(zhì)無法達(dá)到GB 18186-2000的要求。其主要原因是單菌種發(fā)酵中酶系不全，產(chǎn)酯產(chǎn)香條件不夠充分，導(dǎo)致風(fēng)味較差。而復(fù)合菌種發(fā)酵彌補了這些不足，使原料中的蛋白質(zhì)、淀粉、果膠與纖維素的降解率明顯上升，提高了醬油中氨態(tài)氮、有機酸、醇與酯類的含量，使醬油鮮味與醬香味更濃。

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