王英燕，張芙蓉，田智斌

（江蘇神華藥業(yè)有限公司，江蘇金湖211600）

氧載體對番茄紅素發(fā)酵影響

王英燕，張芙蓉，田智斌

（江蘇神華藥業(yè)有限公司，江蘇金湖211600）

目的研究氧載體對番茄紅素發(fā)酵的影響。方法在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，獲得正己烷，正庚烷，正十六烷的最適添加濃度分別為0.2%、0.3%和1%；最適添加時(shí)間是發(fā)酵初期第0 h。采用Box－Behnken設(shè)計(jì)對3種氧載體添加量的協(xié)同作用進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果根據(jù)最優(yōu)預(yù)測結(jié)果，最終得到番茄紅素產(chǎn)率為2.53 g·L－1，對應(yīng)的氧載體添加量分別為正己烷0.30%，正庚烷0.25%，正十六烷0.88%。結(jié)論添加適宜比例的氧載體對番茄紅素的發(fā)酵具有正向促進(jìn)作用。

氧載體；番茄紅素；發(fā)酵；Box－Behnken

番茄紅素是膳食中的一種天然類胡蘿卜素，廣泛存在于自然界的植物中，在人體各組織器官中也有較多分布。番茄紅素有比其他類胡蘿卜素更好的生物活性，并且是防病治病的重要功能因子，已成為目前國際上功能食品成分研究的一個(gè)熱點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品、化妝品等方面都有著良好的應(yīng)用前景［1，2］。如何提高番茄紅素產(chǎn)率是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。在以往的研究中，很多學(xué)者通過菌種誘變，培養(yǎng)基條件優(yōu)化，生產(chǎn)工藝條件優(yōu)化等手段提高番茄紅素的產(chǎn)量。其中，如何增加發(fā)酵體系的溶氧水平也是一個(gè)重要的研究方面。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，微生物開始大量繁殖，對氧氣需求量增大，同時(shí)菌體的生長伴隨著番茄紅素的大量合成，黏度的急劇增加嚴(yán)重阻礙了氧氣的傳遞。較低的溶氧水平是限制番茄紅素產(chǎn)量提高的一個(gè)關(guān)鍵因素。氧載體是一種對微生物無毒、具有較高溶氧能力的有機(jī)物，一般具有比水更高的溶氧能力。液態(tài)烷烴，正十二烷，全氟化碳等均可作為氧載體。這類有機(jī)溶劑與水不相溶，能夠把氧較快的傳遞給發(fā)酵液，

從而提高液相中氧的溶解度［3，4］。Liu等［5］的研究表明在發(fā)酵體系中添加正十二烷可以提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量；Giridhar等［6］發(fā)現(xiàn)正十六烷可以提高L－山梨糖的產(chǎn)量；Umesht等［7］通過在培養(yǎng)基中添加液態(tài)石蠟和正十二烷提高L－天冬酰胺酶的酶活。

但對添加氧載體提高番茄紅素產(chǎn)量的研究數(shù)據(jù)還很少。本文研究了添加不同氧載體對發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的影響，并對氧載體的添加濃度進(jìn)行了優(yōu)化，為實(shí)現(xiàn)番茄紅素大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 三孢布拉氏霉菌ATCC14271（＋），三孢布拉氏霉菌ATCC14272（－），均購自ATCC。

1.2 儀器和設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、30 L全自動(dòng)發(fā)酵罐、超凈工作臺(tái)、高速離心機(jī)、干燥箱。

1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g·L－1）：淀粉40，玉米漿40，葡萄糖25，KH2PO40.5，MgSO40.25，VB少許，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5，在121℃滅菌30 min，備用。

PDA斜面培養(yǎng)基（g·L－1）：土豆提取液1.0 L、葡萄糖20，瓊脂20，VB少許，在121℃滅菌30min，備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L－1）：淀粉10，淀粉糖化液30，玉米漿40，KH2PO40.5，MgSO40.25，VB少許，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5。

1.4 培養(yǎng)條件

1.4.1 孢子懸浮液制備 將三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）原菌經(jīng)活化后，分別接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在28℃條件下，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后在有氧、有光的環(huán)境中，于18℃再繼續(xù)培養(yǎng)48 h，可得生長良好的三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）菌孢子，分別挑取三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）的孢子囊接入已滅菌的生理鹽水中，并用磁力攪拌器攪拌，制得孢子懸浮液。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)良好的三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）菌孢子懸浮液在無菌條件下按1∶2的體積比混合制成種子液。在30 L的發(fā)酵罐中加入5 L初始發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121℃、30 min滅菌后，在無菌條件下接入種子液，在28℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。

1.5 氧載體 正庚烷，正己烷為分析純；正十二烷，正十六烷為進(jìn)口分裝。

1.6 分析方法 細(xì)胞干重（DCW）的測定：將發(fā)酵液離心，把濕菌體置80℃烘箱干燥至恒重后稱重。

番茄紅素含量的測定參考文獻(xiàn)［8］。

1.7 試驗(yàn)方法 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出了可促進(jìn)番茄紅素產(chǎn)量的氧載體分別為正己烷，正庚烷和正十六烷，其最佳添加濃度分別為0.2%、0.3%和1%。在此條件下對發(fā)酵過程的不同時(shí)期添加氧載體，確定氧載體的最佳添加時(shí)間。進(jìn)而采用Box－Behnken設(shè)計(jì)對幾種氧載體的協(xié)同濃度作進(jìn)一步的優(yōu)化。其中Box－Behnken采用Design Expert 8.0數(shù)據(jù)分析軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧載體添加時(shí)間的選擇 考慮到添加劑正己烷和正庚烷在高濃度時(shí)對菌體存在一定的抑制作用，因此有必要研究添加時(shí)間對番茄紅素生物合成的影響。選擇添加劑正庚烷、正己烷和正十六烷，測定不同添加時(shí)間對番茄紅素發(fā)酵的影響。選擇在發(fā)酵的不同時(shí)期（0、24、48、72 h）分別添加0.2%正己烷、0.3%正庚烷和1%正十六烷，考察對發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的影響。結(jié)果如圖1所示，上述幾種氧載體在發(fā)酵48 h加入時(shí)，對菌體生長和產(chǎn)物合成都有明顯的抑制作用，可能菌體生長在此時(shí)處于對數(shù)生長期，外源有機(jī)溶劑的添加會(huì)對該階段的細(xì)胞生長有一定的抑制作用，進(jìn)而影響到穩(wěn)定期番茄紅素的合成。其余時(shí)間點(diǎn)加入氧載體對番茄紅素的生物合成影響不大，其中0 h加入氧載體的效果最好。在后續(xù)研究中均在發(fā)酵初始加入各種氧載體添加劑。

圖1 氧載體不同添加時(shí)間對番茄紅素發(fā)酵的影響

2.2 氧載體對番茄紅素生物合成的協(xié)同作用

2.2.1 氧載體協(xié)同作用對番茄紅素發(fā)酵的影響利用Box－Behnken設(shè)計(jì)對正庚烷、正己烷和正十六烷三種氧載體協(xié)同作用濃度作進(jìn)一步的優(yōu)化。各因素及其水平見表1，Box－Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。每個(gè)因素3個(gè)水平，中心點(diǎn)上作3個(gè)重復(fù)設(shè)計(jì)。

表1 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

續(xù)表2：

以番茄紅素產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0軟件對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果見表3。最小二乘法擬合二次多項(xiàng)式方程，試驗(yàn)因子與響應(yīng)值得關(guān)系可用以下方程表示：

由表3可知，所選模型的不同處理間差異極顯著，說明采用該回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其響應(yīng)變量與自變量之間的二次線性關(guān)系顯著，即該試驗(yàn)方法可靠；決定系數(shù)R2＝94.74%表明相關(guān)性較顯著；失擬項(xiàng)差異不顯著，表明該多項(xiàng)式對試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合情況較好，試驗(yàn)誤差較?。籖2

Pred值為79.97%也能較合理地說明校正決定系數(shù)RAdj2＝85.28%的變化，僅4.14%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)不能用此模型來解釋，信噪比大于4。因此，可以用該方程代替各組試驗(yàn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 Box－Behnken試驗(yàn)因素方差分析表

保持其中單一因素最優(yōu)條件，其他兩個(gè)因素與響應(yīng)值關(guān)系用響應(yīng)面圖和等值線圖表示（如圖2、圖3、圖4所示）。根據(jù)回歸模型預(yù)測出番茄紅素的最高產(chǎn)量，即添加正己烷0.30%、正庚烷0.25%、正十六烷0.88%時(shí)，番茄紅素產(chǎn)率為2.53 g·L－1。

圖2 正庚烷和正己烷交互效應(yīng)對番茄紅素產(chǎn)量的影響

2.2.2 回歸試驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證 為證實(shí)預(yù)測值與真實(shí)值之間的擬合程度，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，即在添加正己烷0.30%、正庚烷0.25%、正十六烷0.88%時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素，其產(chǎn)量分別為2.42、2.58、2.49 g·L－1，試驗(yàn)值與模型估計(jì)值最大相差1.3%，二者非常接近，表明預(yù)測值與試驗(yàn)值有較好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可信程度。

3 結(jié)論

正己烷、正庚烷及正十六烷都能夠明顯促進(jìn)番茄紅素的生物合成，在發(fā)酵初始分別添加0.2%正己烷、0.3%正庚烷和1%正十六烷，番茄紅素產(chǎn)率分別為2.37、2.29和2.25 g·L－1。進(jìn)一步通過響應(yīng)面法Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了三者的協(xié)同濃度，回歸模型預(yù)測出在添加正己烷0.30%、正庚烷0.25%、正十六烷0.88%時(shí)，番茄紅素最高產(chǎn)率為2.53 g·L－1，試驗(yàn)值與預(yù)測值擬合良好，達(dá)到了優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的。該實(shí)驗(yàn)具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐及理論指導(dǎo)意義，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)番茄紅素奠定了一定基礎(chǔ)。

圖3 正庚烷和正十六烷交互效應(yīng)對番茄紅素產(chǎn)量的影響

圖4 正己烷和正十六烷交互效應(yīng)對番茄紅素產(chǎn)量的影響

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Effect of oxygen－vector on lycopene fermentation

WANG Ying-yan，ZHANG Fu-rong，TIAN Zhi-bin
（Jiangsu Shenhua Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jinhu 211600，China）

ObjectiveTo research the effect of oxygen－vector on lycopene fermentation process.M ethods The results of preliminory experiment showed that the optimal concentration of n－h(huán)exane，n－h(huán)eptane，n－h(huán)exadecane added to themedium were 0.2%，0.3%and 1%，respectively.And the optimal adding timewas0 h.The Box－Behnkenmethod was used for the optimization of lycopene production by adding oxygen－vectors.ResultsWhen the fermentation was used under the optimal condition，the lycopene concentration reached 2.53 g·L－1，with the optimal concentration of n－h(huán)exane，n－h(huán)eptane，n－h(huán)exadecane added to themedium were 0.30%，0.25%and 0.88%，respectively.ConclusionThe appropriate proportion of oxygen－vector had a positive role in lycopene fermentation process.

Oxygen－vector；Lycopene；Fermentation；Box－Behnken

TS202.1

A

2095－5375（2014）04－0196－004

王英燕，女，研究方向：藥品與食品研究，E－mail：wyy408＠126.com