孫芳芳，何劍斌

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

沈陽地區(qū)奶牛乳房炎細(xì)菌分離鑒定與優(yōu)勢(shì)菌株藥敏試驗(yàn)

孫芳芳，何劍斌?

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

為更好地制定奶牛乳房炎防治措施，本研究采集了沈陽地區(qū)6個(gè)奶牛場(chǎng)289頭臨床型乳房炎患牛的乳樣進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，共分離得到4類9種細(xì)菌共計(jì)354株細(xì)菌，主要為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌，并對(duì)高發(fā)的大腸桿菌菌株進(jìn)行了19種常見抗生素的藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)哌拉西林、氧氟沙星等高度敏感，對(duì)克林霉素、萬古霉素等高度耐藥。

奶牛乳房炎；細(xì)菌分離鑒定；大腸桿菌；藥敏試驗(yàn)

奶牛乳房炎是奶牛最常見、最多發(fā)且經(jīng)濟(jì)損失最大的疾病，該病廣泛存在于世界各地，是一個(gè)世界性的問題。發(fā)生乳房炎會(huì)造成奶牛的乳腺組織不同程度的損失或破壞，泌乳量大幅減少，乳品質(zhì)下降，所含細(xì)菌也會(huì)危害飲用者的健康[1-2]。目前對(duì)奶牛乳房炎的防治措施主要集中在抗生素治療上，由于諸多原因，導(dǎo)致抗生素的濫用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，耐藥菌株層出不窮，治療過程中效果不佳，成本增加，還會(huì)引起乳中藥物殘留，對(duì)公共衛(wèi)生以及食品安全造成一定的隱患。本研究采集了沈陽地區(qū)部分奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎的奶樣，對(duì)其中引起乳房炎的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)主要細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行研究，旨在對(duì)引起本地區(qū)乳房炎的細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)的研究，為乳房炎的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)為進(jìn)一步的分子流行病調(diào)查提供材料。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和生化試劑培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)、營養(yǎng)肉湯、肉浸液、麥康凱瓊脂、伊紅美蘭瓊脂、DHL瓊脂、MH(A）培養(yǎng)基等購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；甘露醇氯化鈉瓊脂、緩沖葡萄糖蛋白胨、OF培養(yǎng)基、西蒙氏檸檬酸鹽、40%膽汁肉湯、動(dòng)力-吲哚-尿素培養(yǎng)基等購自杭州天和微生物試劑有限公司。

生化試劑：脫纖綿羊血購自南京便診生物科技有限公司；革蘭氏染色液、吲哚試劑、VP甲液、VP乙液、甲基紅試劑、馬尿酸鹽試劑等購自杭州天和微生物試劑有限公司。

生化反應(yīng)管：七葉苷、馬尿酸鈉生化管、水楊素、山梨醇、麥芽糖、木糖、pH9.6肉湯、6.5%高鹽肉湯、苦杏仁苷、阿拉伯糖、棉籽糖、山梨醇、肌醇、DNA、鳥氨酸、氨基酸脫羧酶、血清菊糖、膽汁七葉苷、鼠李糖、硫化氫、蜜二糖、枸櫞酸鹽、β-半乳糖苷（ONPC）、紫牛乳、水楊酸、硝酸鹽（還原）、0.1%美蘭牛乳等購自杭州天和微生物試劑有限公司。

藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 乳樣采集根據(jù)乳房炎判定標(biāo)準(zhǔn)[3]，分別從沈陽周邊6個(gè)奶牛場(chǎng)采集臨床型乳房炎奶樣289份，患牛均處于泌乳期。采樣前，用溫水清洗乳房后用75%酒精進(jìn)行消毒，棄去頭三把奶以排除環(huán)境微生物的污染[4]。將采集奶樣收集在裝有2 mL滅菌營養(yǎng)肉湯的小試管后，封裝，標(biāo)記牛號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室后37℃培養(yǎng)18 h后進(jìn)行分離鑒定。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定用接種環(huán)取培養(yǎng)后的菌液1鉑耳環(huán)在綿羊血瓊脂平板上劃線接種，觀察培養(yǎng)24～72 h。取形態(tài)與溶血環(huán)不同的單個(gè)菌落劃線接種于普通瓊脂，并涂片革蘭氏染色鏡檢，反復(fù)此過程直到培養(yǎng)出單個(gè)純菌落。對(duì)于在普通瓊脂上不生長(zhǎng)的菌株，則繼續(xù)用血瓊脂平板劃線純培養(yǎng)。

將純培養(yǎng)菌落分別劃線接種于高鹽甘露醇培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，根據(jù)鏡檢結(jié)果、培養(yǎng)特性與選擇性培養(yǎng)基初步判定，將分離純化的細(xì)菌分別進(jìn)行不同的生化鑒定試驗(yàn)。其中對(duì)在高鹽甘露醇生長(zhǎng)，在麥康凱不生長(zhǎng)的短桿菌，利用葡萄球菌科細(xì)菌生化編碼手冊(cè)進(jìn)行鑒定；對(duì)在麥康凱生長(zhǎng)，在高鹽甘露醇不生長(zhǎng)的球菌，利用腸桿菌屬細(xì)菌生化編碼冊(cè)進(jìn)行鑒定；以《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[5-7]等為依據(jù)，對(duì)其他細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.4 主要細(xì)菌藥敏試驗(yàn)為保證分離鑒定的準(zhǔn)確性，將分離得到的優(yōu)勢(shì)菌株送上海生工進(jìn)行16srNA測(cè)序，結(jié)果正確后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用國際通用的KB紙片擴(kuò)散法[8]。取純培養(yǎng)菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18～24 h，對(duì)達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木哼M(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用滅菌長(zhǎng)棉簽沾取菌液，并在試管壁輕輕按壓以擠出多余菌液，用長(zhǎng)棉簽均勻涂布MH瓊脂平板，待瓊脂表面干燥后，將藥敏片用無菌鑷子等距離貼在瓊脂平板上[9]。37℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑，依據(jù)NCCLS抗菌藥物藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)和解釋，判定其對(duì)各類藥物的敏感性，分別記做高度敏感（S），中度敏感（I），耐藥為（R）。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 主要細(xì)菌分離鑒定結(jié)果從289份臨床乳房炎患牛奶樣中共檢出4類19種細(xì)菌，共計(jì)354株。細(xì)菌種類分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、肺炎克雷伯菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、其他革蘭氏陽性桿菌、志賀菌屬、木糖葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、腐生葡萄球菌、牛棒狀桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣芽胞梭菌、變形桿菌屬。其中大腸桿菌63株，占比19.7%；金黃色葡萄球菌49株，占比15.4%，無乳鏈球菌39株，占比12.2%。266份樣本檢出單一細(xì)菌，占比92.0%，21份樣本檢出2～3種細(xì)菌，占比7.2%，2份樣本無檢出。

結(jié)果表明，感染奶牛乳房炎的病原微生物主要為大腸桿菌，其次為金黃色葡萄球菌與無乳鏈球菌。奶牛乳房炎的發(fā)病多以單一感染為主，由兩種或兩種以上細(xì)菌混合感染的情況相對(duì)較少。

2.2 大腸桿菌生物學(xué)特性鑒定結(jié)果見表1。

表1 大腸桿菌主要生物學(xué)特性Table1 The main biological characteristics of E.coli

大腸桿菌不同菌株的生化反應(yīng)結(jié)果并不相同。符合枸櫞酸鹽、吲哚、與葡萄糖產(chǎn)氣標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果的大腸桿菌的比例低于90%，差異性較大。甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、木糖、H2S的結(jié)果符合率為100%，無差異。

2.3 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of E.coli susceptibility test %

從表2中可以看出，大腸桿菌對(duì)臨床常用的抗生素均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，其中耐藥程度最高的分別為克林霉素、萬古霉素、青霉素，耐藥率分別為78%、75%、65%。對(duì)哌拉西林、氧氟沙星、鏈霉素、諾氟沙星有較高的敏感性，敏感度分別為75%、72%、66%、66%，可作為臨床參考用藥。

3 討論

奶牛乳房炎由多種病原微生物引起，不同地區(qū)、同一地區(qū)不同奶牛場(chǎng)的發(fā)病情況也有所不同[10-11]，這也是進(jìn)行區(qū)域乳房炎流行病學(xué)調(diào)查的根本出發(fā)點(diǎn)。在對(duì)沈陽地區(qū)289份的奶樣的病原微生物進(jìn)行分離鑒定后，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的檢測(cè)率超過金黃色葡萄球菌，為導(dǎo)致本地區(qū)乳房炎感染的主要細(xì)菌。大腸桿菌一般來自環(huán)境，要根除環(huán)境細(xì)菌性乳房炎是很困難的。這也提示了本地區(qū)飼養(yǎng)管理、環(huán)境衛(wèi)生等環(huán)節(jié)存在一定問題。因此防控奶牛乳房炎，要從根本上改變管理不完善、衛(wèi)生不整潔、消毒不徹底、擠奶不科學(xué)和干奶不合理等的現(xiàn)狀。

目前，對(duì)于奶牛乳房炎的治療國內(nèi)外仍然以抗生素為主，但長(zhǎng)期的濫用與亂用抗生素導(dǎo)致了大量耐藥菌株的出現(xiàn)[12]。從試驗(yàn)結(jié)果可知，導(dǎo)致奶牛乳房炎的大腸桿菌對(duì)常用的抗生素已經(jīng)產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，其中耐藥程度最高的分別為克林霉素、萬古霉素、青霉素等，長(zhǎng)期以來牛場(chǎng)慣于采用的干奶期使用青霉素封閉乳頭的做法，導(dǎo)致了沒有任何一株分離得到的大腸桿菌對(duì)其高度敏感。這與國內(nèi)外報(bào)道的結(jié)果基本一致[13-15]。防治奶牛乳房炎，不僅要做到科學(xué)管理從源頭上杜絕微生物感染，還要合理選用抗生素。避免長(zhǎng)期頻繁使用同一種或同一類抗生素，要做到交叉用藥，中西藥結(jié)合治療也有很好的效果[16]，盡量減少抗生素使用量。預(yù)防重于治療，治療做到科學(xué)系統(tǒng)有原則，才能有效控制奶牛乳房炎的發(fā)生。

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（編輯：韓斌）

Bacteria isolation and identification of cow mastitis and antibiotic sensitivity testof the predom inantstrains in Shenyang area

Sun Fangfang,He Jianbin*
（Col lege of Animal Science and veterinary medicine,Shenyang Agricultural University, Liaoning Shenyang 110866）

In order to bet ter develop prevention measures of cow mastitis,6,289 mi lk samples f rom dairy cows suf fering f rom cl inical mastitis in Shenyang area were col lected and used for bacterial isolation and identi f ication.Four classes total ing 3,549 kinds of bacteria were isolated, mainly Escherichia coli,Staphylococcus aureus,St reptococcus agalactiae,and St reptococcus uberis.The antibiotic sensitivity test revealed that E.col i st rains were highly sensitive to piperacil l in,of loxacin,clindamycin,and vancomycin.

Cowmastitis;bacterial isolation and identi fication;E.col i;susceptibi lity testing

S852.61

：B

：1672-9692(2014)02-0044-04

2013-12-31

孫芳芳（1982-），女，碩士研究生，研究方向奶牛疾病防治。

何劍斌（1969-），男，博士，教授，主要研究方向奶牛疾病防治。