段朝霞，張潔元，陳魁君，李曉霞，王建民，李兵倉(cāng)

多巴胺D2受體(DRD2)是多巴胺受體之一，屬于G蛋白偶聯(lián)家族，能通過(guò)與 Gi/Go偶聯(lián)抑制cAMP的形成，在體內(nèi)發(fā)揮重要作用。DRD2主要分布于紋狀體內(nèi)，參與認(rèn)知、情緒、運(yùn)動(dòng)及內(nèi)分泌等多種功能活動(dòng)的調(diào)節(jié)［1］。人類DRD2基因位于第11號(hào)染色體，全長(zhǎng)270 kb，共有8個(gè)外顯子。大量研究證實(shí)，DRD2基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)、抑郁癥、精神分裂癥、藥物及酒精成癮等精神類疾病發(fā)生的易患性及藥物治療的敏感性相關(guān)［2-5］。本課題組前期的研究通過(guò)HapMap檢索發(fā)現(xiàn)DRD2基因第3內(nèi)含子區(qū)51 103 bp位點(diǎn)的rs2075652多態(tài)性可能與PTSD的易患性相關(guān)，然而截至目前該位點(diǎn)的具體生物學(xué)機(jī)制還不十分清楚。鑒于此，本研究擬構(gòu)建含單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs2075652位點(diǎn)的DRD2基因熒光素酶表達(dá)載體，為今后探索其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pmirGlo質(zhì)粒、海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pRL-SV40、DNA純化試劑盒和雙熒光素酶報(bào)道基因試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒、基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司;高保真DNA聚合酶、膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶購(gòu)于Takara公司(大連);限制性內(nèi)切酶Sac I、Xho I購(gòu)自NEB公司;脂質(zhì)體Lipofectine 2000TM為Invitrogen公司產(chǎn)品;DMEM、胎牛血清購(gòu)自Gibco;人胚腎癌細(xì)胞株HEK293購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，為本研究組保存，培養(yǎng)于含有 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中;感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α和培養(yǎng)基等其他試劑均由南方中心實(shí)驗(yàn)室提供;PCR引物由上海生物工程有限公司合成;PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒測(cè)序均由Takara公司(大連)完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含rs2075652多態(tài)位點(diǎn)的第3內(nèi)含子區(qū)序列擴(kuò)增及純化:按照北京天根生物技術(shù)有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)提取人全血基因組DNA，經(jīng)核酸定量?jī)x定量后置于-70℃?zhèn)溆?。根?jù)DRD2基因組序列NC-000011.9 Reference GRCh37.p5 Primary Assembly(GenBank，上下游各延伸 10 kb的序列范圍:113270317～113356001)，設(shè)計(jì)4條擴(kuò)增DRD2第3內(nèi)含子區(qū)序列及51 103 bp位點(diǎn)突變的引物。rs2075652-1:5＇ ctgcactggacactggggactctag 3＇，rs2075652-2:5＇cttggggatccttgccggttact 3＇;rs2075652-M1:5＇atcccaactaccatttgtaaagtgcttac 3＇;rs2075652-M2:5＇gtaagcactttacaaatggtagttgggat 3＇。以人全血基因組DNA為模板，先用rs2075652-1與rs2075652-2擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)序列，并克隆至PTA2載體中，測(cè)序鑒定正確后，再雙酶切(Sac I+Xho I)，然后亞克隆至pmir-Glo載體。含突變位點(diǎn)的序列則以PTA2-652質(zhì)粒為模板，以引物rs2075652-1和rs2075652-M1、引物rs2075652-2和rs2075652-M2分別進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)后，再以兩段 PCR產(chǎn)物為模板，以rs2075652-1和rs2075652-2為引物，進(jìn)行融合PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)均采用25μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為:98℃ 5 min，98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。取 5 μl PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.2.2 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定:膠回收的PCR產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)改造的報(bào)告基因載體pmirGlo均以Sac I和Xho I雙酶切，對(duì)目的條帶采用膠回收并進(jìn)行純化。純化過(guò)的DNA片段和質(zhì)粒按2︰1的比例，在 T4 DNA連接酶作用下連接2 h，得到重組質(zhì)粒pmirGlo-DRD2-T和pmirGlo-DRD2-C。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌，于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基平皿上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。挑取其中3個(gè)克隆擴(kuò)增并經(jīng)Sac I和Xho I雙酶切和測(cè)序鑒定。測(cè)序工作由Takara公司(大連)完成。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后重懸，細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/ml，各取200 ml/孔接種于48孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度為80%左右時(shí)，將重組質(zhì)粒pmirGlo-DRD2-T和pmirGlo-DRD2-C轉(zhuǎn)染細(xì)胞，為校正孔間轉(zhuǎn)染效率，各組均用表達(dá)海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pRLSV40同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法:首先形成Lipofectine-DNA復(fù)合物，室溫靜置20 min后，將Lipofectine-DNA復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 h后更換成含10%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取各次平均值。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性:取細(xì)胞裂解液20μl，在其中加入100μl的Firefly luciferase檢測(cè)試劑，混勻后立即在化學(xué)發(fā)光儀中檢測(cè)發(fā)光值，記錄10 s時(shí)的值(對(duì)應(yīng)于Firefly的表達(dá)水平);然后再加入100μl的stop＆Glo試劑，同樣檢測(cè)10 s時(shí)的化學(xué)發(fā)光值(對(duì)應(yīng)于Renilla熒光素酶的表達(dá)水平)，以二者比值(F/R)為校正后的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 含rs2075652多態(tài)位點(diǎn)的第3內(nèi)含子區(qū)序列PCR擴(kuò)增 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下可見(jiàn)1條明顯的DNA條帶位于399 bp附近，與所需擴(kuò)增片段大小相符，且無(wú)非特異性擴(kuò)增片段，此條帶即為設(shè)計(jì)擴(kuò)增含rs2075652位點(diǎn)T的目的片段(見(jiàn)圖1A)。將目的片段克隆至PTA2載體中，進(jìn)行測(cè)序鑒定。再以PTA2-652質(zhì)粒為模板，以引物rs2075652-1和rs2075652-M1、引物rs2075652-2和rs2075652-M2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)出278 bp和189 bp的目的條帶(見(jiàn)圖1B);再以兩段 PCR產(chǎn)物為模板，以 rs2075652-1和rs2075652-2為引物，進(jìn)行融合 PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出399 bp的含rs2075652突變位點(diǎn)C的目的條帶(見(jiàn)圖1C)。

圖1 含rs2075652-多態(tài)位點(diǎn)的第3內(nèi)含子區(qū)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A.用rs2075652-1和rs2075652-2引物、人基因組DNA為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;M.DL2000 DNA Marker，1.擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。B.用rs2075652-1、rs2075652-M1和 rs2075652-M2、rs2075652-2兩對(duì)引物分別擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物;M.DL2000 DNA Marker，1.rs2075652-1、rs2075652-M1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，2.rs2075652-M2、rs2075652-2擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。C.用rs2075652-1和rs2075652-2為引物、B的兩種PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增的融合PCR產(chǎn)物;M.DL2000 DNA Marker;1.融合擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌克隆、培養(yǎng)，隨機(jī)挑取3個(gè)單菌落中的少許菌體為模板進(jìn)行擴(kuò)增并經(jīng)Sac I和Xho I雙酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2，得到大小為7 kb左右的pmirGlo質(zhì)粒片段和含rs2075652 T和rs2075652 C的第3內(nèi)含子區(qū)的目的條帶。1號(hào)克隆送公司進(jìn)行測(cè)序分析，其測(cè)序結(jié)果與GenBank中的DRD2基因啟動(dòng)子序列比對(duì)后完全一致，證實(shí)重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，測(cè)序結(jié)果(常見(jiàn)多態(tài)位點(diǎn)為反向測(cè)序，突變位點(diǎn)為正向測(cè)序)見(jiàn)圖3。

圖2 多巴胺D2受體-T和多巴胺D2受體-C重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定M.DL15000 DNA Marker;1.pmirGlo-DRD2-T質(zhì)粒雙酶切;2.pmirGlo-DRD2-C質(zhì)粒雙酶切

2.3 熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性 轉(zhuǎn)染pmirGlo-DRD2-C質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液中熒光素酶活性(0.542±0.004)強(qiáng)于轉(zhuǎn)染pmirGlo-DRD2-T質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液(0.474±0.016)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，見(jiàn)圖4。

3 討論

DRD2是最受關(guān)注、也是研究最多的多巴胺受體之一。既往研究顯示，DRD2是與PTSD關(guān)系最為密切的多巴胺受體，因?yàn)榇蠖鄶?shù)經(jīng)典的抗精神病藥物的藥理學(xué)作用中都有拮抗DRD2的作用，且藥物效價(jià)與拮抗強(qiáng)度有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)邊緣系統(tǒng)中杏仁核等區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)元對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激高度敏感［6］。在中樞應(yīng)用DRD2激動(dòng)劑阿撲嗎啡可以降低白鼠實(shí)驗(yàn)性創(chuàng)傷應(yīng)激后的死亡率，而多巴胺受體阻滯劑舒必利則有相反的效果，而PTSD患者的尿中多巴胺及其代謝產(chǎn)物高香草醛酸濃度增高，其水平與癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)［7］。PTSD患者中樞神經(jīng)多巴胺系統(tǒng)可能存在缺陷，而無(wú)法適宜地應(yīng)對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激，導(dǎo)致暫時(shí)或持續(xù)性的精神異常癥狀。因此，DRD2基因改變可能是導(dǎo)致各種精神異常行為、精神及神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要原因［8-10］。

自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，內(nèi)含子一直是人們爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。因內(nèi)含子屬于非編碼序列，曾一度被認(rèn)為其存在沒(méi)有任何意義，是無(wú)用基因，因此目前對(duì)內(nèi)含子的功能還知之甚少。然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子并不是基因組的“垃圾”，而是在基因表達(dá)調(diào)控中有重要的生物學(xué)功能。另外，在原核生物基因中不存在內(nèi)含子或含有少量的內(nèi)含子，而在真核生物基因中內(nèi)含子的存在是普遍現(xiàn)象，內(nèi)含子的長(zhǎng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外顯子，甚至在人類基因組中非編碼序列占到95% ～97%［11］。由此可見(jiàn)，生物進(jìn)化程度越高，其內(nèi)含子所含比例也越高，這也進(jìn)一步說(shuō)明內(nèi)含子是具有重要生物學(xué)功能的。對(duì)于內(nèi)含子的功能，目前普遍認(rèn)為它們與基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，如內(nèi)含子含有增強(qiáng)子或其他順式作用元件，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始或延伸，增加了mRNA在核內(nèi)的穩(wěn)定性，可充當(dāng)啟動(dòng)子等。因含有增強(qiáng)啟動(dòng)子的序列，在一些基因中，內(nèi)含子可增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄的起始反應(yīng)。內(nèi)含子由于含有增強(qiáng)子的組分，或由于拼接體及多聚腺昔酸化作用保護(hù)mRNA前體，使其免受RNA酶的作用，增強(qiáng)了基因的表達(dá)。在另一些基因中，內(nèi)含子可抑制轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)錄衰減位點(diǎn)可能位于內(nèi)含子上，從而導(dǎo)致基因的失活［12］。

報(bào)告基因是一種編碼可供檢測(cè)的酶或蛋白質(zhì)的基因，是基因表達(dá)調(diào)控研究的一個(gè)重要工具，通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物，可以推測(cè)出該DNA片段在基因表達(dá)調(diào)控中的作用［13］。本研究采用高保真PCR法從人全血基因組中擴(kuò)增出了DRD2基因第3內(nèi)含子區(qū)399 bp的含rs2075652多態(tài)位點(diǎn)的序列，并將其分別克隆到pmirGlo-Basic質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，成功構(gòu)建了人 pmirGlo-DRD2-T和 pmirGlo-DRD2-C熒光素酶報(bào)告基因，并證實(shí)了rs2075652多態(tài)位點(diǎn)由T突變?yōu)镃后，熒光素酶活性增強(qiáng)，說(shuō)明DRD2基因第3內(nèi)含子區(qū)55 103位點(diǎn)可能為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)位點(diǎn)或具有增強(qiáng)子活性，為研究DRD2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)，但其增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的具體分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

圖3 重組質(zhì)粒的pmir Glo-DRD2-T和pmir Glo-DRD2-C的測(cè)序結(jié)果

圖4 重組質(zhì)粒pmir Glo-DRD2-T和pmir Glo-DRD2-C熒光素酶活性比較結(jié)果b P＜0.01

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