符小航 連李斌 康汝光 車虹彩 仝臘娟 楊鑒冰 崔曉萍 賀豐杰

陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（咸陽712046）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在青春期后，40歲前發(fā)生的非生理性的月經(jīng)停止，伴有潮熱、原發(fā)或繼發(fā)不孕、全身和生殖器萎縮的疾病［1］。本病在一般人群中發(fā)病率為1%～3%，在閉經(jīng)者中占2%～10%，近年來發(fā)病率有逐年上升的趨勢［2］。目前西醫(yī)主要以雌激素替代療法為主，但長期應(yīng)用會增加患者罹患乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險，故臨床應(yīng)用受到限制。中醫(yī)藥治療本病療效確切且無明顯副作用，中藥有多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)的整體調(diào)節(jié)作用，具有明顯的調(diào)節(jié)內(nèi)分泌能力，特別是能提高卵巢性激素受體的含量［3］。歸腎育宮湯是陜西省名中醫(yī)楊鑒冰教授依據(jù)“腎主生殖”理論，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立的治療卵巢早衰的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效顯著，但其作用機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察歸腎育宮湯對免疫性卵巢早衰小鼠外周血清性激素的影響，揭示該方的作用機(jī)制，為卵巢早衰的中醫(yī)藥治療提供可靠的臨床依據(jù)。

1 材 料 1．1 動物 SPF級雌性昆明小鼠60只，體重（20±5）g，合格證號：SCX（陜）2007-001，西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1．2 藥物及試劑 結(jié)合雌激素片：新疆新姿源生物制藥有限責(zé)任公司，批號：20130402；歸腎育宮湯組方：熟地、紫河車、杜仲、鹿角霜、山萸肉各10g，枸杞子、川斷各12g，制首烏、山藥、茯苓、雞血藤、焦山楂各15g，菟絲子20g，炙甘草6g，所有中藥由陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房提供；透明帶多肽3（ZP3）：美國 GenScript公司，純度98．1%，批號：5004321-1；弗氏完全佐劑：美國Sigma公司產(chǎn)品；弗氏不完全佐劑：美國Sigma公司產(chǎn)品；卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、透明帶抗體ELISA試劑盒，上海西唐生物科技有限公司；水合氯醛：上海山浦化工有限公司

1．3 儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀：ELX808，美國Bio-Tek公司；光學(xué)顯微鏡：蔡司光學(xué)儀器（上海）公司。

2 方 法 2．1 POF模型制備 取1．4445mgZP3透明帶多肽粉末，加入1mL三蒸水配置成溶液，每1mL溶液與弗氏完全佐劑按1：1比例配制成免疫試劑，與弗式不完全佐劑按1：1配制成免疫強(qiáng)化試劑，每只小鼠取0．1mL免疫試劑多點(diǎn)注射雙后腳掌及腹腔，14d后以免疫強(qiáng)化試劑0．1mL多點(diǎn)注射小鼠雙后腳掌及腹腔加強(qiáng)免疫。

2．2 分組及給藥 60只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、雌激素組、歸腎育宮湯大劑量組、歸腎育宮湯中劑量組、歸腎育宮湯小劑量組。雌激素組用結(jié)合雌激素片按0．3mg／人／d，根據(jù)小鼠與人的體表面積進(jìn)行換算；各中藥治療組藥物均水煎后去滓，濃縮，調(diào)配濃度，使小劑量歸腎育宮湯溶液每毫升含生藥0．525g；中劑量歸腎育宮湯溶液每毫升含生藥1．05g；大劑量歸腎育宮湯溶液每毫升含生藥2．1g。每只小鼠灌胃量均為1mL，空白組、模型組灌胃相同量蒸餾水，連續(xù)灌胃4周，每周休息1d。

2．3 動情周期觀察 用生理鹽水潤濕棉簽，取陰道脫落細(xì)胞涂于載玻片上，自然干燥后甲醇固定1h，Giemsa染色20min，0．01MPBS沖洗3次，光學(xué)顯微鏡觀察。本實(shí)驗(yàn)采用的小鼠正常性周期為4～6d，包括動情前期（9～18h）、動情期（6～12h）、動情后期（30～48h）和動情間期（36～42h）。造模之日起，每天早上8：00陰道脫落細(xì)胞涂片觀察小鼠動情周期的變化，以出現(xiàn)動情周期紊亂表示造模成功。

2．4 外周血清性激素的檢測 動物股動脈取血，3000轉(zhuǎn)／min，離心15min，取上清，按試劑盒說明書用ELISA法檢測外周血清性激素卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）水平。

2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，組間比較用SNK法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果 3．1 歸腎育宮湯對小鼠外周血清卵泡刺激素和黃體生成素的影響 與空白組比較，模型組卵泡生成素和黃體刺激素顯著升高（P＜0．05）；給藥治療后與模型組比較，雌激素組、歸腎育宮湯大、中、小劑量組卵泡刺激素和黃體生成素顯著降低（P＜0．05）；與雌激素組比較，中、小劑量組卵泡刺激素升高，大、歸腎育宮湯中劑量組黃體生成素降低（P＜0．05）；與大劑量比較，中、小劑量組卵泡刺激素和黃體生成素均升高（P＜0．05）。

表1 各組小鼠外周血清卵泡刺激素和黃體生成素水平比較（±s）

表1 各組小鼠外周血清卵泡刺激素和黃體生成素水平比較（±s）

注：與空白組比較，△P＜0．05；與模型組比較▲P＜0．05；★與雌激素組比較P＜0．05，☆與大劑量組比較P＜0．05。

組 別 n 卵泡刺激素（IU／L） 黃體生成素 （ng／L）10 0．64±0．01 166．14±3．03模型組 10 0．94±0．01△ 255．38±4．85△雌激素組 10 0．69±0．02▲ 186．27±3．63▲歸腎育宮湯大劑量組 10 0．64±0．02▲★ 167．66±1．53▲★歸腎育宮湯中劑量組 10 0．70±0．01▲☆ 173．12±3．43▲★☆歸腎育宮湯小劑量組 10 0．73±0．03▲☆ 182．76±2．64空白組▲☆

3．1 歸腎育宮湯對小鼠外周血清雌二醇和孕酮的影響與空白組比較，模型組雌二醇和孕酮顯著降低（P＜0．05）；給藥治療后與模型組比較，雌激素組、歸腎育宮湯大、中、小劑量組雌二醇和孕酮顯著升高（P＜0．05）；與雌激素組比較小劑量組雌二醇和孕酮降低，大量組孕酮升高（P＜0．05）；與大劑量比較，中、小劑量組雌二醇和孕酮均降低（P＜0．05）。

表2 各組小鼠外周血清雌二醇和孕酮水平比較（±s）

表2 各組小鼠外周血清雌二醇和孕酮水平比較（±s）

注：與空白組比較，△P＜0．05；與模型組比較▲P＜0．05；◇與雌激素組比較P＜0．05，◆與大劑量組比較P＜0．05。

組 別 n 雌二醇（ng／L） 孕酮（pmol／L）10 5．41±0．26 154．32±3．20模型組 10 2．84±0．08△ 126．85±3．22△雌激素組 10 5．47±0．27▲ 144．18±2．54▲歸腎育宮湯大劑量組 10 5．62±0．30▲ 150．98±2．13▲◆歸腎育宮湯中劑量組 10 5．29±0．11▲◇ 144．58±3．30▲◇歸腎育宮湯小劑量組 10 4．88±0．17▲◇◆ 137．32±2．49空白組▲◇◆

4 討 論 本病屬中醫(yī)學(xué)“血枯”、“血隔”、“閉經(jīng)”、“不孕癥”等范疇。《內(nèi)經(jīng)》云：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長；二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時而下；……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”。《醫(yī)學(xué)正傳·婦人科》載：“月經(jīng)全借腎水施化，腎水既乏，則經(jīng)血日以干涸?！笨梢妺D女月經(jīng)的生理活動，其主導(dǎo)在腎，調(diào)節(jié)在天癸，約束在沖任，藏瀉在胞宮，所以說其根在腎［4］。楊鑒冰教授依據(jù)“經(jīng)水出諸腎”、“腎主生殖”的理論創(chuàng)立了歸腎育宮湯，臨床療效確切且無副作用［5-6］。為進(jìn)一步探明歸腎育宮湯的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)自身免疫異常的機(jī)制采用透明帶多肽成功復(fù)制了POF小鼠動物模型，模型成功后可見卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）升高，F(xiàn)SH水平明顯高于LH，而雌二醇下降。經(jīng)歸腎育宮湯給藥治療后，可見大中劑量組小鼠血清FSH、LH水平顯著降低，雌二醇和孕酮含量明顯升高，對小鼠POF有顯著的治療作用，且療效優(yōu)于雌激素，表明歸腎育宮湯可能通過調(diào)節(jié)性激素水平對POF起到治療作用，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］ 楊 冰，葉 元．卵巢早衰［J］．華夏醫(yī)學(xué)，2004，4（19）：833-835．

［2］ 楊業(yè)洲．卵巢早衰［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：102-108．

［3］ 姚石安．卵巢早衰中醫(yī)證治需注意哪些方面［J］．中醫(yī)雜志，1998，39（5）：313．

［4］ 賀愛華．中醫(yī)論治卵巢早衰［J］．吉林中醫(yī)藥，2007，27（7）：1-2．

［5］ 任潔寧，楊鑒冰．楊鑒冰教授治療卵巢早衰用藥經(jīng)驗(yàn)介紹［J］．現(xiàn)代中醫(yī)藥，2009，25（3）：1-2．

［6］ 楊鑒冰．補(bǔ)腎育宮湯配合西藥治療卵巢早衰22例［J］．陜西中醫(yī)，2009，30（7）：773-774．