張曉強(qiáng) 王 娟 劉品莉 程玉釧

周曉莉 趙劍鋒 趙惠萍 張劍 陳 鑫山西省中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(太原030012)

目前鮮有關(guān)于過敏性紫癜(AP或HSP)動(dòng)物模型的文獻(xiàn)報(bào)道，有關(guān)本病病因、病機(jī)的探索、治療方法的評價(jià)和新藥的研發(fā)在很大程度上受到限制。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性地采用中西醫(yī)結(jié)合思路造模。制作出較為相似、可靠的HSP大鼠模型，且其臨床指標(biāo)、病理改變均接近人類HSP?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)方法 1．1 材料與方法 1．1．1動(dòng)物與分組:健康純種SD大鼠40只，清潔級(jí)，體重(180±20g)，6周齡，♀♂各半，由山西省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物室供應(yīng)(使用許可證:SYXK(晉)2010-0002，質(zhì)量合格證:0000036)，實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。適應(yīng)喂養(yǎng)1周后對40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和對照組(各20只)，依據(jù)分組不同分籠飼養(yǎng)于代謝籠中，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料及水。之后對模型組大鼠進(jìn)行造模。期間對照組采用等量生理鹽水灌胃及注射。

1．1．2 主要試劑和儀器:主要試劑和藥物:胡椒、干姜、蓽茇中藥配方顆粒劑(批號(hào)分別為:1008098，1011058，1007020，江陰天江藥業(yè)有限公司);脂多糖(LPS)10mg裝(批號(hào)326A055，Sigma L2880，北京索萊寶科技有限公司);雞卵蛋白(OVA)普通級(jí)，10g裝(批號(hào) 20110112，Sigma A5253，北京索萊寶科技有限公司分裝);氫氧化鋁凝膠4%g/mL，100mL裝(批號(hào)201102103，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司);伊文思藍(lán)(批號(hào)7116588，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);0．9%氯化鈉注射液2．25g，250mL(批號(hào) N12040304-1，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。

1．1．3 方法:1．1．3．1血熱證動(dòng)物模型的建立:干姜、蓽茇、胡椒以1:1:1比例在60℃恒溫水浴鍋上濃縮成12．5g%mL水溶液，置4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將?dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境1周后予模型組大鼠灌胃，0．14 g/只，均2次/d，對照組給予等量生理鹽水灌胃，自由飲食。用藥3周。

1．1．3 ．2 過敏反應(yīng)試驗(yàn):之后將模型組大鼠給予腹腔注射含OVA1mg+氫氧化鋁凝膠0．5mL+800ng LPS+1%伊文思藍(lán)的生理鹽水1mL/只，1次/7d，共2次。第二次注射后10min內(nèi)皮膚外涂含OVA1mg+氫氧化鋁凝膠0．5mL+800ng LPS的生理鹽水1mL/只進(jìn)行激發(fā)過敏反應(yīng)。對照組用等量生理鹽水操作。激發(fā)過敏30min后處死動(dòng)物，剪取背部皮膚，觀察皮內(nèi)層的出血點(diǎn)。

1．2．2 模型觀察與指標(biāo)檢測:1．2．2．1 一般狀況觀察:包括不同組別、不同時(shí)段鼠體溫、精神狀況、進(jìn)食進(jìn)水量、毛被、活動(dòng)量、舌苔、口唇、結(jié)膜、耳廓、糞便顏色和硬軟度、尿液量、顏色、氣味等。

1．2．2 ．2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測定:在實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組大鼠隨機(jī)處死10只。處死大鼠前24h留取尿液，用全自動(dòng)尿液分析儀測定尿常規(guī)和尿沉渣定量。之后對上述大鼠取血約10mL，1h內(nèi)用全自動(dòng)血流變分析儀觀測血液流變性(包括全血粘度、血沉等);用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀觀測血常規(guī)(血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等)。

1．2．2 ．3 皮膚和腎臟一般觀察及病理檢查:觀察兩組不同時(shí)段實(shí)驗(yàn)大鼠皮內(nèi)層有無瘀點(diǎn)、瘀斑出現(xiàn)。在實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組大鼠各取4只，觀察腎臟外形，并切取部分腎組織置于40g/L中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，分別行HE染色，在光鏡下觀察腎組織病理改變。

1．2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差示，由SPSS 16．0軟件統(tǒng)計(jì)處理，采用One-Way ANOVA單因素方差分析，LSD和S-N-K法作組間比較。

2 結(jié)果與分析 2．1 一般情況 對照組大鼠精神、攝食均較正常;模型組大鼠在進(jìn)行了3周中藥灌胃后出現(xiàn)不同程度的口渴喜飲、進(jìn)食量稍大、精神萎靡不振或煩躁、呼吸頻率增高、口唇發(fā)干、耳廓赤紅、眼結(jié)膜充血、糞便干燥、小便發(fā)黃、偶見鼻衄。在第1次腹腔注射含OVA1mg+氫氧化鋁凝膠0．5mL+800ng LPS+1%伊文思藍(lán)的生理鹽水后出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、鼠毛蓬亂，在第2次注射后情況加重，并有2例大鼠死亡(死因可能系超敏反應(yīng))，之后各組大鼠均未出現(xiàn)死亡。在進(jìn)行皮毛外涂擦上述藥物后，有部分皮膚紫癜出現(xiàn)(見圖1-1，1-2)，此情況約1周可自行緩解。

2．2 尿液檢查 2．2．1血尿:對照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程均未出現(xiàn)肉眼血尿和鏡下血尿。造模前模型組大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)陰性，在造模后大鼠均出現(xiàn)紅細(xì)胞超量。試驗(yàn)后模型組大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)較實(shí)驗(yàn)前及對照組試驗(yàn)后顯著增多 (均P＜0．01)。見表1。

表1 對照組與模型組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)/μl)( ±s)

表1 對照組與模型組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)/μl)( ±s)

注:與對照組相比△P＜0．05▲P＜0．01;與實(shí)驗(yàn)前相比◇P ＜0．05 ◆P ＜0．01。下同。

組別 動(dòng)物數(shù) 實(shí)驗(yàn)前 試驗(yàn)后對照組10 5．00 ±1．31 4．88 ±1．36模型組 10 5．27 ±0．41 18．52 ±1．28▲◆

2．2．2 尿蛋白:造模前模型組大鼠尿蛋白定性陰性，在造模后模型組出現(xiàn)尿蛋白。試驗(yàn)后模型組大鼠尿蛋白定量較實(shí)驗(yàn)前及對照組試驗(yàn)后顯著增多(均P＜0．01)。見表2。

2．3 血液檢查 2．3．1血液流變性:造模后動(dòng)物的全血粘度較造模前及對照組試驗(yàn)后在低切、中切、高切下明顯增高(P＜0．01或P＜0．05);造模后動(dòng)物的血沉較造模前及對照組試驗(yàn)后明顯增高(均P＜0．01)。表明血液粘度增高，流動(dòng)性變差;紅細(xì)胞聚集性增加。見表3及表4。

2．3．2 血常規(guī):造模后動(dòng)物的PLT、WBC值較造模前及對照組試驗(yàn)后明顯增高(P＜0．01)，表明免疫炎癥狀態(tài)較重。見表5。

表2 對照組與模型組尿蛋白定量變化(mg/24h)( ± s)

表2 對照組與模型組尿蛋白定量變化(mg/24h)( ± s)

組別 n 實(shí)驗(yàn)前 試驗(yàn)后對照組10 49．72 ±3．57 51．11 ±4．33模型組 10 47．48 ±3．42 152．52 ±21．39▲◆

表3 模型組與對照組大鼠全血粘度(mPa/s)比較±s

表3 模型組與對照組大鼠全血粘度(mPa/s)比較±s

組 別 n 低切實(shí)驗(yàn)前 試驗(yàn)后中切實(shí)驗(yàn)前 試驗(yàn)后高切實(shí)驗(yàn)前 試驗(yàn)后對照組 10 13．30 ±2．88 13．17 ±3．40 5．16 ±0．81 4．97 ±0．92 4．42 ±1．03 4．73 ±1．09模型組 10 12．97 ±2．48 14．26 ±4．10▲◆ 5．47 ±0．73 7．29 ±0．56▲◆ 4．52 ±0．94 6．15 ±0．90▲◆

表4 模型組與對照組大鼠血沉比較±s(mm/h)

表4 模型組與對照組大鼠血沉比較±s(mm/h)

組別 n 實(shí)驗(yàn)前 試驗(yàn)后對照組10 8．78 ±3．37 9．06 ±5．09模型組 10 9．12 ±3．56 79．72 ±13．57▲◆

2．4 腎組織病理學(xué)改變 對照組大鼠實(shí)驗(yàn)前后腎表面光滑，顏色淺褐，皮、髓質(zhì)分界清晰。模型組部分大鼠腎腫大，顏色暗紅，個(gè)別表面可發(fā)現(xiàn)皺起，皮、髓分界可見模糊。光鏡觀察顯示模型組大鼠腎臟表現(xiàn)出部分腎小球分葉不明顯，系膜區(qū)略增寬，輕中度的系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，基底膜增厚，膠原纖維沉積增多(黑褐色)，提示HSP模型亦有同人類患者相似的腎臟受損(見圖 1、圖2、圖3、圖4)。

表5 模型組與對照組大鼠血常規(guī)指標(biāo)比較(×109)(±s)

表5 模型組與對照組大鼠血常規(guī)指標(biāo)比較(×109)(±s)

組 別 nPLT實(shí)驗(yàn)前 試驗(yàn)后WBC實(shí)驗(yàn)前 試驗(yàn)后對照組 10 735．96 ±127．55 729．15 ±127．13 8．49 ±2．56 8．70 ±2．83模型組 10 689．34 ±135．27 1116．79 ±224．89▲◆ 8．66 ±1．91 14．91 ±3．77▲◆

3 討 論 過敏性紫癜(Ailegric Puprura，AP)，又稱亨諾-許蘭紫癜(Henoch-schonlein purpura，HSP)，是一種常見的血管變態(tài)反應(yīng)性出血性疾病［1］。本病并發(fā)癥多，復(fù)發(fā)率高，病程遷延，患病率逐年升高［2-3］。有關(guān)HSP的研究已成為近年來過敏性疾病研究的熱點(diǎn)之一。目前本病病因尚不完全明了，一般認(rèn)為與過敏有關(guān)，但在臨床上致敏原常不易確定。眾多研究發(fā)現(xiàn)該病病理主要是免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾?。?］，多克隆B淋巴細(xì)胞(B Lymphocyte，BC)活化及 Ig的分泌增加［5］。血管壁免疫復(fù)合物(Immunocomplex，IC)沉著，通透性增高，血液及淋巴液滲到組織間隙，引起皮膚黏膜、內(nèi)臟器官滲出性出血和水腫。本病發(fā)病同時(shí)有細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的參與，凝血機(jī)制也參與發(fā)病，遺傳免疫因素的作用不可忽視。Moja等［6］在檢測HSP患者血清后認(rèn)定IgAI、分泌型IgA及抗麥膠蛋白IgA是HSP致病的重要抗體。另有多篇報(bào)道認(rèn)為HSPN和IgA腎病(IgAnephropathy，IgAN)在腎臟病理改變上極為相似，難以區(qū)分，都是由IgA免疫異常所致。另有國內(nèi)學(xué)者對HSP患兒進(jìn)行血液流變學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，無論是全血表觀黏度、血液黏度、還是血漿黏度均增高，并有血沉增高，紅細(xì)胞壓積增大，提示存在高粘滯血癥［7］，可加重免疫介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

上述研究成果與中醫(yī)學(xué)對HSP病因病機(jī)的理解不謀而合，中醫(yī)認(rèn)為HSP患者多為先天稟賦偏頗，復(fù)感外邪而發(fā)病:患者先天陰虛質(zhì)燥，營血之中已有伏火，復(fù)受風(fēng)熱、溫?zé)峄蛩幎局?，從而兩熱相搏，深入血分釀成本病。張蕊鸝［8］在碩士論文中通過對普通兒童和HSP兒童體質(zhì)分布的研究，結(jié)果顯示小兒的體質(zhì)特點(diǎn)是決定HSP發(fā)生的內(nèi)因。HSP兒童中醫(yī)體質(zhì)不均衡質(zhì)構(gòu)成比以偏陰虛質(zhì)(64．38%)最多，偏陰虛質(zhì)與HSP的發(fā)病有緊密聯(lián)系。而中醫(yī)血熱證動(dòng)物模型具有較強(qiáng)的高粘滯血癥、免疫活化及一般表現(xiàn)如皮膚紫斑、發(fā)熱、煩躁、耳紅、眼赤、溲赤、便干等［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性地模擬HSP的病因病機(jī)進(jìn)行其模型的制備，即根據(jù)HSP的公認(rèn)的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，從病因、病理等諸方面和中醫(yī)學(xué)HSP病人體質(zhì)特點(diǎn)，采用中西醫(yī)結(jié)合思路造模(即使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物達(dá)到“病證結(jié)合，病癥統(tǒng)一”的目的)。首先參照文獻(xiàn)建立血熱證動(dòng)物模型造就實(shí)驗(yàn)動(dòng)物陰虛火旺的偏頗體質(zhì)，后應(yīng)用麥膠蛋白作為飲食抗原，持續(xù)性抗原刺激粘膜免疫系統(tǒng)，致BC多克隆活化，并應(yīng)用經(jīng)典的皮膚過敏手段建立HSP大鼠動(dòng)物模型。本大鼠模型與對照組大鼠各組指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模組的全血粘稠度、白細(xì)胞、血小板、尿液分析及沉渣定量等指標(biāo)與對照組相比有明顯差異(P＜0．01或P＜0．05)。本實(shí)驗(yàn)所建立的HSP大鼠動(dòng)物模型接近于HSP現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，并與中西醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)的HSP患者體質(zhì)特點(diǎn)合拍，基本達(dá)到“病證結(jié)合，病癥統(tǒng)一”。

2011年筆者發(fā)表《過敏性紫癜動(dòng)物模型的研制思路》后，國內(nèi)數(shù)家研究單位及學(xué)者通過筆者的實(shí)驗(yàn)思路［12］與本實(shí)驗(yàn)基本同步進(jìn)行了研究。如張奕星［13］等，綜合模擬瘀熱證與IgA腎病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，復(fù)合建造HSPN模型，模型組大鼠雖然未出現(xiàn)明顯皮下紫癜，但存在血尿及蛋白尿，腎臟病理及免疫組化結(jié)果支持造模成功;李彥紅［14］等通過對日本大耳白兔熱性藥物的喂飲、腹腔注射卵白蛋白和弗氏完全佐劑生理鹽水的混合液，耳緣靜脈和背部皮內(nèi)注射卵白蛋白生理鹽水，激發(fā)過敏反應(yīng)來構(gòu)建HSP模型，結(jié)果顯示大耳白兔癥狀、病理改變和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果與人類HSP病變基本相似，有望構(gòu)建良好的(HSP)兔模型。

另外韓冰虹［15］在2004年度黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文的實(shí)驗(yàn)里采用口服麥膠蛋白的飲食抗原法建立的HSP動(dòng)物模型，選用20只昆明種雌性小鼠模型實(shí)驗(yàn)，僅有3例小鼠出現(xiàn)了皮下紫癜表現(xiàn)，其皮膚和腎臟組織形態(tài)學(xué)變化，與患者皮膚、腎臟病理改變基本一致。張雅絢［16］在2010年度遼寧中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文的實(shí)驗(yàn)里采用卵白蛋白為抗原免疫家兔，之后在家兔背部皮內(nèi)注射卵白蛋白局部激發(fā)arthus反應(yīng)(局限性免疫復(fù)合物沉積引起的變態(tài)反應(yīng))，只是在針刺部位出現(xiàn)皮膚紅、腫、熱之表現(xiàn)。上述模型的制作為高相似度HSP動(dòng)物模型建立打下了一定的基礎(chǔ)，其功勞值得肯定。

3 展望及不足 本課題所設(shè)計(jì)的動(dòng)物模型思路也將廣泛應(yīng)用于其它HSP研究。從而使中西醫(yī)學(xué)對HSP以及其他類似疾病的科研及診治跨上一個(gè)新臺(tái)階。

由于實(shí)驗(yàn)條件的限制、時(shí)間緊張及筆者的能力所限，本實(shí)驗(yàn)尚有指標(biāo)檢測方面的遺憾，如本實(shí)驗(yàn)未能測定大鼠血清白蛋白、球蛋白、補(bǔ)體等免疫指標(biāo);本實(shí)驗(yàn)并沒有使大多數(shù)模型大鼠出現(xiàn)皮膚紫癜表現(xiàn)。期待在以后的實(shí)驗(yàn)中可以得到完善和改進(jìn)。

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