鄭旭銳 惠 毅 閆曙光 宋 逍 王禮鳳 王李君 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽712046）

肝纖維化是指肝細(xì)胞發(fā)生炎癥刺激或壞死時(shí)，各種致病因子致肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）增生和降解之間失去應(yīng)有的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積、肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程，其進(jìn)一步發(fā)展即可以導(dǎo)致肝硬化、肝癌。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約有3000萬慢性肝炎患者，其中約有20%～40%可發(fā)展為肝硬化乃至肝細(xì)胞癌［1］。三甲散源自明代末年著名溫病學(xué)家吳又可的著作《溫疫論》，其具有融滋陰、活血、行氣、逐瘀的作用，對(duì)邪正交渾而成久病入絡(luò)的痼疾頗為適宜，近年來三甲散日益受到現(xiàn)代醫(yī)家的關(guān)注［2-6］，我們本次擬從三甲散對(duì)肝星狀細(xì)胞（HSC）細(xì)胞活化增殖，初步揭示三甲散抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料 三甲散藥液：由鱉甲、龜甲、穿山甲、?蟲、生牡蠣、僵蠶、白芍、當(dāng)歸、甘草組成，以上藥物均購自陜西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房，藥物加水浸泡常規(guī)煎煮、過濾，水浴蒸發(fā)濃縮至每毫升含生藥3．5g。三甲散按1mL／100g藥液經(jīng)胃灌藥（1次／d），連續(xù)灌胃7d，最后一次灌藥（灌藥前應(yīng)禁食不禁水12h）1h后，腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清，56℃水浴中滅活30min，0．44um微孔濾膜過濾，-20℃冷藏備用；Y-27632（美國(guó)ALEXIS公司）；大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6（購自上?？蠌?qiáng)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2．1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 HSC-T6細(xì)胞接種在100mL的培養(yǎng)瓶中（按1×105個(gè)／cm2），之后用DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100U／mL鏈霉素和100U／mL青霉素）培養(yǎng)，在飽和濕度為5%，溫度為37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖情況及時(shí)更換培養(yǎng)液（周期約為每2～3d／次）。

2．2 細(xì)胞傳代 HSC-T6細(xì)胞傳代步驟分列如下：①選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，細(xì)心吸去培養(yǎng)液，再加入0．25%的胰蛋白酶；②37℃消化3min；③加入DMEM（含10%FBS）培養(yǎng)液；④輕輕吹打培養(yǎng)瓶的瓶壁，收集細(xì)胞懸液后離心5min（1000r／min）；⑤棄去上清液后加入 DMEM 培養(yǎng)液（含10%FBS）重懸，之后以5×104個(gè)／cm2接種。

2．3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)液＋HSC-T6細(xì)胞）、三甲散組（DMEM培養(yǎng)液＋HSC-T6細(xì)胞＋6mmol／L三甲散）、Y-27632陽性對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)液＋HSC-T6細(xì)胞＋10μmol／L Y-27632）。

2．4 MTT法檢測(cè)三甲散對(duì)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響 方法步驟如下：①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞消化及離心；②用DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS）將細(xì)胞配制成5×104個(gè)／mL的細(xì)胞懸液；③加入96孔（按200μL／孔）的培養(yǎng)板中，在溫度為37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去上清液；④根據(jù)上述分組每組6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組每個(gè)孔再加入DMEM培養(yǎng)液（含20%FBS）的量為100μL，處理組每個(gè)孔分別加入三甲散藥液和Y-27632（各100μL的量）；④培養(yǎng)24h后棄去上清；⑥每孔分別加入無血清180μL的DMEM培養(yǎng)液及20μL的 MTT（5mg／mL），混合均勻，在培養(yǎng)箱中孵育4h，棄去上清液；⑦加入DMSO裂解細(xì)胞（按100μL／孔）；⑧在酶標(biāo)儀上振蕩溶解10min，然后以570nm測(cè)定吸光度（A）值。

2．5 計(jì)算各組的平均生長(zhǎng)抑制率

計(jì)算公式：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-［（A處理-A調(diào)零）／（A處理-A調(diào)零）］×100%，以三甲散和作用濃度為橫軸，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為縱軸EXCEL軟件繪制時(shí)效反應(yīng)曲線。

2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果采用SPSS13．0軟件統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析及SNK檢驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 三甲散和Y-27632作用于HSC-T6細(xì)胞24h后，發(fā)現(xiàn)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖明顯減少（P＜0．05），每天更換培養(yǎng)液，并分別于12h，24h，36h，48h用 MTT法測(cè)定HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率從12h即開始升高，24h達(dá)到峰值，隨后又逐漸下降，但仍高于12h（見表1、圖1）。

表1 三甲散和Y-27632對(duì)HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

4 討 論 目前研究認(rèn)為肝纖維化是向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)環(huán)節(jié)［7-8］，HSC的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)［9］，HSC在組織炎癥壞死區(qū)域向肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）轉(zhuǎn)型的激活過程，HSC激活過程包括增加細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的頻率、丟失儲(chǔ)存維生素A的生理功能、ECM的合成功能及收縮性增強(qiáng)、細(xì)胞形狀改變?yōu)镸FB等等，HSC還可以通過分泌趨化因子和細(xì)胞因子等環(huán)節(jié)參與肝臟的炎性過程［10］。因此阻斷HSC的活化與增殖是延緩肝纖維化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

三甲散方來源于明代著名的溫病學(xué)家吳又可的著作《溫疫論》。在《溫疫論·主客交》中這樣寫道：“補(bǔ)之則邪火愈熾，泄之則損脾壞胃，滋之則膠邪愈固，散之則經(jīng)絡(luò)益虛，疏之則精氣愈耗，守之則日消近死……所謂客邪膠固于血脈，主客交渾，最難得解，且愈久愈固，治法當(dāng)乘其大肉未消，真元未敗，急用三甲散，多有得生者”［11］，此處所說的“主”是指正氣、氣血，“客”指外來的邪氣?！爸骺徒弧钡囊馑际侵杆伢w正氣已經(jīng)虛衰，陰精耗竭非常嚴(yán)重，客邪留戀不去，正氣虛弱不能逐邪外出，客邪不得從外解，與虛竭之營(yíng)血相互膠結(jié)留滯于血脈而成的一種頑固變證。與虛、瘀、毒互結(jié)，痹阻絡(luò)脈的絡(luò)病實(shí)質(zhì)基本相同，因此，“主客交”的核心在于絡(luò)病陰傷，其中氣滯血瘀痰凝又是絡(luò)病的基本病理變化。吳又可所說的三甲散是治療“主客交”的主要方劑，方中的藥物主要有鱉甲、龜甲、?蟲、生牡蠣、穿山甲、僵蠶、白芍、當(dāng)歸、甘草，其中的鱉甲、龜甲祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其是屬于血肉有情之品，它們既可以驅(qū)逐陰分之邪，又可以滋養(yǎng)身體的精血；合牡蠣、僵蠶、穿山甲、?蟲以入絡(luò)搜邪散結(jié)；方中的當(dāng)歸、白芍、甘草主要起益氣養(yǎng)血的作用，這些藥物合用共奏軟堅(jiān)散結(jié)、養(yǎng)肝通絡(luò)之功。綜觀全方具有融滋陰、行氣、活血、逐瘀的作用，對(duì)久病入絡(luò)，邪正交渾而成的痼疾非常適宜［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三甲散對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖具有抑制作用，且在作用24h達(dá)到高峰，隨后抑制率又逐漸下降，我們的研究結(jié)果說明三甲散是一種有前景的抗肝纖維化藥物。其抗纖維化的作用機(jī)制很可能是通過抑制 HSC-T6細(xì)胞增殖活化、ECM合成來實(shí)現(xiàn)的，值得進(jìn)一步的研究探討。

［1］ 王寶恩．肝纖維化的診斷與嚴(yán)重度評(píng)估［J］．中華肝臟病雜志，1998，6（4）：193．

［2］ 閆 穎．從“主客交”論治肝纖維化的思考［J］．湖南中醫(yī)雜志，2008，24（5）：84-86．

［3］ 鄭秀麗．從“主客交”論治慢性乙肝纖維化的理論探討［J］．江蘇中醫(yī)藥，2008，40（9）：20-21．

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［10］ Guyot C，Lepreux S，Combe C，et al．Hepatic fibrosis and cirrhosis the（myo）fibroblastic cell subpopulations in-volved［J］．Int J Biochem Cell Biol，2006，38（2）：135．

［11］ 明·吳有性著，浙江中醫(yī)學(xué)院研究所評(píng)注．《溫疫論》評(píng)注［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，1977：308-310．