王曉萍 石會麗 李富賢 雷 琨 馮一凡 米彩峰 陜西省中醫(yī)醫(yī)院（西安710003）

苦刺花（Sophora viciifolia Hance）為豆科槐屬植物，野生落葉灌木。由于苦刺花根、莖、葉、花、果和種子均入藥，且有清熱燥濕，消炎止痢，涼血解毒等功效。民間用于治療咽喉腫痛、肺熱咳嗽、濕熱痢疾，痔瘡腫毒，皮膚瘙癢等［1］。均含有苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿，槐定堿，槐胺堿，苦丁堿等13種生物堿［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明其生物堿具有多方面的生物活性，抗癌、抗炎抗過敏和增加免疫力等獨特的藥理作用。但未見苦刺花種子中四種生物堿含量分析測定方法的相關(guān)報道。本研究以其種子為材料，采用HPLC法同時測定其堿含量，可為苦刺花種子內(nèi)在質(zhì)量的評價提供參考和理論依據(jù)。

1 儀器、試劑及試藥 儀器：日本島津LC-2010A型高效液相色譜儀，UV-VIS紫外-可見檢測器，CLASS-VP色譜工作站，四元溶劑系統(tǒng)，柱溫箱；ZORBAX-C18柱（250mm×4．6mm）；電子分析天平（型號：BP211D，d=0．01mg，德國塞多利斯天平有限公司），超聲波清洗器（型號：KQ-100，昆山市超聲儀器有限公司）。Millipore美國超純水制備系統(tǒng)；FW117型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

試劑：甲醇為色譜純；氨水、氯仿、磷酸為分析純；水為自制超純水；對照品氧化苦參堿（供含測用，批號110780-200405），氧化槐果堿（供含測用，批號111652-200301），苦參堿（供含測用，批號110805-200507），購于中國藥品生物制品檢定所?；惫麎A（本實驗室自制并鑒定，含量＞99．9%）。

試藥：采集于陜西柳林鎮(zhèn)的野生白刺花種子、果實、花、根、葉，并由本所馮一凡研究員鑒定為豆科槐屬植物苦刺花。

2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX-C18柱（4．6mm×250mm，5μm）色譜柱，預(yù)保護柱：Phenomenex，Security Guard，流動相為0．4mol·L-1磷酸溶液-甲醇（9：1）；流速1．0mL／min；檢測波長220nm；柱溫30oC；試樣進樣量10μL；檢測時間12min。測定結(jié)果，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿與氧化槐果堿可以完全達到基線分離。該方法能夠用于白刺花及其他生物材料的氧化苦參堿等上述四種生物堿的分析測定。

檢測時間15min，理論塔板數(shù)以3號色譜峰計，不低于1萬。采用優(yōu)化的色譜條件下，可以在15min的分析時間內(nèi)實現(xiàn)對4個被測化合物的完全分離，混合對照品（A）和苦刺花種子樣品（B）的色譜圖見下圖。

3 方法與結(jié)果 3．1對照品溶液的制備 分別精密稱取苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿各適量，置于50mL容量瓶中，用0．4moL·mL-1磷酸-甲醇（9：1）溶解并定容至刻度，配制成混合對照品，其濃度分別為 0．113mg·mL-1、0．320mg·mL-1、0．545mg·mL-1、1．43mg·mL-1。

3．2 供試品溶液的制備 苦刺花粉碎（過40目篩），取0．2g，精密稱定，加入濃氨溶液0．2mL，濕潤，加入25mL氯仿，超聲處理30min，過濾，殘渣同上法再處理2次，各加氯仿15mL，合并濾液，蒸干，殘渣用流動相洗滌溶于5mL量瓶中，溶液過0．45μm微孔濾膜，即為樣品供試溶液。

3．3 線性關(guān)系的考察 標準曲線的建立，分別取適量的標準品混合儲備液，再依次用流動相稀釋至標準曲線所需的濃度。每個成分在上述色譜條件下測定5個不同濃度，每個濃度的標準溶液重復(fù)配置測定3次，通過峰面積與標品濃度建立標準曲線，將3次結(jié)果平均得到最終標準曲線，見表2。

表2 苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿的標準曲線

3．4 精密度試驗 精密吸取同一對照品混合溶液與供試品溶液各10μL，分別在1d內(nèi)，連續(xù)進樣6次，計算日內(nèi)精密度，苦參堿，槐果堿；氧化槐果堿和氧化苦參堿相對峰面積積分的RSD分別為1．06%，1．21%，1．26%，1．35%；供試品溶液測定各堿的RSD分別為0．640%，1．84%，0．689%，1．058%；表明儀器精密度良好。

3．5 重復(fù)性實驗 取6份同一批藥材約0．2g，精密稱定，按3．2方法平行制備，在上述色譜條件下進行分析，分別計算白刺花種子樣品中苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿的質(zhì)量分數(shù)，其RSD分別為0．726%，0．808%，0．982%和1．061%。

3．6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液10μL，分別在0，4，12，24，36，48h進樣分析，分別測定色譜峰峰面積。苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿，峰面積的 RSD 分別為0．678%，1．012%，1．002和1．482%。表明48h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

3．7 回收率試驗 精密稱取白刺花種子粉末0．1g（40目），9份，按要求分別精密加入已知濃度的不同對照品溶液適量，按3．2方法平行制備供試品。按上述色譜條件分別進樣10μL進行測定（n=3），結(jié)果苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿的平均回收率分別為101．18%，101．09%，98．72%，98．47%，RSD分別為1．75%，1．22%，1．16%，1．23%。

3．8 樣品分析 精密稱取苦刺花不同部位粉末各0．2，按上述供試品方法制備，以10μL進樣，測定色譜峰峰面積，根據(jù)標準曲線計算其質(zhì)量分數(shù)，見表3。

表3 苦刺花不同部位的四種生物堿含量測定結(jié)果

4 討 論 4．1 供試品制備方法的考察 根據(jù)四種生物堿的物理性質(zhì)及有關(guān)文獻資料［3-5］，提取溶劑考察了甲醇和甲醇-水（80%甲醇）；無水乙醇和乙醇-水（80%）；先石油醚處理后再甲醇提??；先氨水潤濕后用氯仿提取和稀鹽酸水溶液（pH3左右）提取等，發(fā)現(xiàn)氨水潤濕后氯仿提取效果好，而且雜質(zhì)干擾少。同時采用不同提取方法如（回流、冷浸、超聲）和不同提取時間，通過測定比較最終確定提取條件為超聲30min，提取3次，每次加溶劑25mL，苦刺花種子中的四種生物堿提取效率高。

4．2 色譜柱、波長和流速的選擇 在實驗中考察YMC-Pack ODS-A，Shim-Pack VP-ODS［2］，ZORBAXC18，Phenomenex GeminiC18［3-6］柱，不同波長、柱溫和流速。最后選用ZORBAX-C18色譜柱，檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1．0mL·min-1進行含量測定，各色譜峰之間分離效果好。

4．3 流動相的選擇 為了能在盡量短的分析時間內(nèi)獲得指標成分的完全分離，分別用甲醇、甲醇-醋酸水、甲醇-磷酸水系統(tǒng)、乙腈-醋酸水、乙腈-三乙胺、三乙胺溶液、乙腈-磷酸水（磷酸0．1moL·L-1～0．5moL·L-1）體系洗脫［3-6］進行反復(fù)摸索。乙腈洗脫能力強，出峰快，分離度差；結(jié)果改用甲醇-磷酸水溶液后改善了分離度。最終確定用甲醇-0．4moL·L-1磷酸水溶液（1：9）為流動相，可使各生物堿成分達到有效分離，峰形穩(wěn)定，可用于苦刺花的質(zhì)量控制。

［1］ 張志英，梁固城，劉淑芬，等．陜西中藥名錄［M］．陜西科學技術(shù)出版社，1998：98．

［2］ 溫 敏，毛曉健．白刺花化學成分及抗炎、抗過敏作用研究狀況［J］．云南中醫(yī)中藥雜志，2006，1（27）：63-65．

［3］ 宋玉琴，魏玉輝，武新安．RP-HPLC法測定苦豆子總堿注射液中槐定堿、苦參堿和槐果堿的含量［J］．蘭州大學學報（醫(yī)學版），2007，4（33）：24-26．

［4］ 吳志嬌，趙 紅，薛 英，等．HPLC法同時測定氧化槐果堿、槐定堿、和苦參堿［J］．中國科學院研究生院學報，2011，28（3）：399-400．

［5］ 古麗娜·沙比爾，阿吉艾克拜爾·艾薩，石明輝，等．HPLC同時測定苦豆子中槐定堿，氧化槐果堿和氧化苦參堿［J］．中國中藥雜志，2007，32（24）：2619-2621．

［6］ 李彤暉，馬久太，李 曄，等．燥濕清熱顆粒中苦參堿和氧化苦參堿含量測定方法的研究［J］．陜西中醫(yī)，2013，34（7）：899-901．