劉紅梅, 師廣波, 李向東, 孫中濤,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安 271018;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東泰安 271018)

復(fù)合酶法水解花生粕制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化

劉紅梅1, 師廣波1, 李向東2, 孫中濤1,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安 271018;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東泰安 271018)

以DPPH自由基清除率和收率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合酶法水解花生粕生產(chǎn)抗氧化性肽工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化.研究結(jié)果表明,堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)花生粕具有較強(qiáng)的水解能力,二者以2∶1的比例對(duì)花生粕水解時(shí),較優(yōu)水解條件是50℃,pH值8.54,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.34%.在此條件下酶解16 h,花生肽收率為65.80%,在花生肽質(zhì)量濃度為0.55 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基清除率為25.77%,與優(yōu)化前相比,復(fù)合酶比堿性蛋白酶單酶水解時(shí)收率和DPPH自由基清除率分別提高了7.48%和7.66%,比中性蛋白酶單酶水解時(shí)分別提高了10.29%和22.53%.

堿性蛋白酶;中性蛋白酶;花生肽;抗氧化性

花生(Arachis hypogaeaLinn.)是世界上最重要的油料作物之一.近年來(lái),中國(guó)花生年產(chǎn)量逾1 000 萬(wàn)t,位列世界首位,榨油后的副產(chǎn)品花生粕年產(chǎn)量大于150萬(wàn)t[1].花生粕蛋白質(zhì)含量高,氨基酸組成合理,價(jià)格相對(duì)低廉,是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源[2].但花生粕的溶解性、乳化性和起泡性等物化性質(zhì)較差,限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[2].

采用蛋白酶對(duì)花生粕適度水解,不僅可改善其物化性質(zhì),還可提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3].酶解產(chǎn)物的主要成分是不同分子量的花生肽,花生肽不僅易于吸收利用,還具有較強(qiáng)的抗氧化等生物活性[4],可用于功能性食品以減輕氧自由基和活性氧簇對(duì)人體的損害,也可用作抗氧化添加劑來(lái)防止食品脂質(zhì)氧化[5].

影響花生肽抗氧化性的因素很多,包括蛋白酶的種類和水解溫度、pH值、底物濃度、酶底比(E/S)、水解時(shí)間等工藝條件,優(yōu)化這些工藝條件可顯著提高花生肽的抗氧化性[1,6].目前的研究多以提高花生肽的水解度和收率為研究目標(biāo),而對(duì)如何提高花生肽的抗氧化性研究較少.事實(shí)上,肽類物質(zhì)的抗氧化性與水解度有關(guān),但并不是水解度越高抗氧化性越強(qiáng),因此水解過(guò)程宜以抗氧化能力作為優(yōu)化目標(biāo),而不是簡(jiǎn)單的追求最大水解度[6].本研究以花生肽的抗氧化性和收率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法對(duì)花生粕的酶解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化,以提高花生肽的抗氧化性.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要原料與試劑

花生粕購(gòu)自泰安,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.9%;堿性蛋白酶(2×105U/mL)購(gòu)自南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;中性蛋白酶(2×105U/g)與木瓜蛋白酶(2×105U/g)均購(gòu)自南寧龐博生物工程有限公司;風(fēng)味蛋白酶(500MG)與復(fù)合蛋白酶(protamex,1.5AU-N/g)均購(gòu)自諾維信公司;DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)自由基與D-果糖均購(gòu)自Solarbio公司;甘氨酸購(gòu)自Sanland-chem International Inc;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.2 儀器

DHZ-D型恒溫振蕩器,蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;PHSJ-4A型pH計(jì),上海雷磁儀器廠;Spectrum lab S22型可見(jiàn)分光光度計(jì),上海棱光技術(shù)有限公司;JA1003型電子天平,上海恒平科學(xué)儀器有限公司.

1.2 分析方法

1.2.1 水解度的測(cè)定[7]

蛋白酶水解蛋白質(zhì)的實(shí)質(zhì)是肽鍵的斷裂,由此導(dǎo)致ɑ-氨基氮的含量增加.ɑ-氨基氮含量增加得越多,表明水解的程度越大,因此,可用水解后生成的ɑ-氨基氮的量占總含氮量的百分比表示水解度.如式(1).

水解后生成的α-氨基態(tài)氮的量采用茚三酮法測(cè)定[8],樣品總含氮量由凱氏定氮法測(cè)定[9].

1.2.2 抗氧化性的測(cè)定

采用Tomako等[10]的方法,將酶解后的濾液適當(dāng)稀釋,取2 mL稀釋液添加至2 mL 0.1～0.2 mmol/L DPPH的無(wú)水乙醇溶液中,混合均勻,室溫下黑暗處放置30min,于517 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)l;以體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液,按文獻(xiàn)[10]方法測(cè)定吸光度A2;以95%乙醇溶液代替花生肽稀釋液,按文獻(xiàn)[10]方法測(cè)定吸光度A3. DPPH自由基清除能力按式(2)計(jì)算.

1.2.3 花生肽收率的測(cè)定

酶解液過(guò)濾后,將濾餅于80℃的烘箱中烘干,準(zhǔn)確稱量干重.花生肽的收率按式(3)計(jì)算.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白酶的選擇

在250mL的三角瓶中加入10 g花生粕和90 mL去離子水,將其混勻后置于90℃水浴鍋中加熱10min,待其溫度降至55℃時(shí),將pH值分別調(diào)至各種蛋白酶的最適pH值,即采用風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶水解者調(diào)至pH值為7.0,采用堿性蛋白酶水解者調(diào)至pH值為8.0.分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%(E/S,以底物重量計(jì))的上述蛋白酶,在55℃的恒溫振蕩器中150 r·min-1振蕩酶解4 h,然后在90℃水浴中保溫10 min,將蛋白酶滅活.將酶解液用真空泵抽濾,取適量澄清的濾液測(cè)定DPPH自由基清除率.將濾餅置于80℃的烘箱中烘干,稱重并計(jì)算收率.

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

酶的用量、溫度、pH值與底物濃度等工藝條件的優(yōu)化采用單因素實(shí)驗(yàn).酶解的基本條件是加酶量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%(E/S,以底物質(zhì)量計(jì)),底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%,pH值為8.0,55℃,酶解16 h.改變其中一個(gè)條件,其他條件保持不變,分別考察各參數(shù)對(duì)DPPH自由基清除率、收率和水解度的影響.

1.3.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

以溫度、pH值與底物濃度3個(gè)因子為研究對(duì)象,并以DPPH自由基清除率和收率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn),各因素與水平見(jiàn)表1.用Design Expert7.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析并構(gòu)建二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,見(jiàn)式(4).

式(4)中,Y為響應(yīng)值(DPPH自由基清除率和收率);xi、xj為自變量編碼值;αo為常系數(shù);αi為線性系數(shù);αii為二次項(xiàng)系數(shù);αij為交互項(xiàng)系數(shù).

表1 Box-Behnken試驗(yàn)的因素和水平Tab.1 Experimental factors and levels of independent variables in Box-Behnken Design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶水解物對(duì)DPPH自由基清除率與收率的影響

各種蛋白酶水解物對(duì)DPPH自由基清除率與收率的影響如圖1.由圖1可見(jiàn),中性蛋白酶與堿性蛋白酶水解物的DPPH自由基清除率與收率均最高,二者之間差異不顯著(P＞0.05),但與其他蛋白酶的差異均達(dá)到了顯著水平(P＜0.05),因此,堿性蛋白酶和中性蛋白酶均可用于花生肽的生產(chǎn).鑒于不同蛋白酶的水解位點(diǎn)不同,本研究將堿性蛋白酶與中性蛋白酶按2∶1的比例混配成復(fù)合酶,對(duì)花生粕進(jìn)行水解,以提高花生肽的水解度、收率和抗氧化性.

圖1 不同蛋白酶對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率和收率的影響Fig.1 Effect of different proteases on DPPH radical scavenging ability and yield of peanut peptides

2.2 蛋白酶用量對(duì)花生肽的 DPPH自由基清除率、收率與水解度的影響

圖2 蛋白酶用量對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、水解度和收率的影響Fig.2 Effect of dosage of proteases on DPPH radical scavenging ability,degree of hydrolysis, and yield

蛋白酶用量對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、水解度與收率的影響如圖2.由圖2可見(jiàn),蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%(E/S)增至3%(E/S)時(shí),DPPH自由基清除率、水解度和收率增加較快;但繼續(xù)增加酶量,三者增加的速度變緩.其原因是蛋白酶用量較低時(shí),增加用量可增大酶和底物結(jié)合頻率,加快水解速度,使水解度、抗氧化能力和收率迅速增大;當(dāng)?shù)鞍酌赣昧枯^高時(shí),酶的濃度不再是水解反應(yīng)的限速因素,再增加酶量,水解速度不再顯著增加.綜合考慮抗氧化性、收率和生產(chǎn)成本,選擇3%(E/S)為較佳蛋白酶用量.

2.3 溫度對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、收率與水解度的影響

溫度對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、收率與水解度的影響如圖3.由圖3可見(jiàn),溫度較低時(shí),隨著溫度的升高,收率與水解度逐漸增大,至50℃達(dá)到最大值,此后,再升高溫度,收率與水解度反而下降.當(dāng)溫度從45℃增至50℃,DPPH自由基清除率顯著上升;從50℃增至60℃時(shí),DPPH自由基清除率緩慢上升;從60℃增至65℃時(shí),DPPH自由基清除率再一次顯著上升,這說(shuō)明其變化趨勢(shì)與水解度并不一致.相關(guān)研究證明,蛋白酶解物的抗氧化性與水解度有關(guān),但并非水解度越高,抗氧化性越強(qiáng)[6,11].因此,抗氧化肽的生產(chǎn)工藝的優(yōu)化,宜以其抗氧化性為響應(yīng)值,而不能簡(jiǎn)單地以提高水解度為目的.綜合抗氧化性和收率,本研究選擇55℃為較佳反應(yīng)溫度.

圖3 溫度對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、水解度和收率的影響Fig.3 Effect of temperature on DPPH radical scavenging ability,degree of hydrolysis,and yield

2.4 pH值對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、收率與水解度的影響

pH值對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、收率與水解度的影響如圖4.由圖4可見(jiàn),pH值較低時(shí),增加pH值,收率顯著上升,pH值7.0后再增加pH 值,收率的增加不再顯著.在pH值為6.3～10.0 時(shí),DPPH自由基清除率與水解度有隨著pH值增加而一直增大的趨勢(shì).鑒于在較高pH值條件下水解時(shí)需消耗大量的NaOH,水解后中和還需消耗大量的HCl,產(chǎn)品鹽分也較高,需增加脫鹽工序,成本高,且存在環(huán)境污染,本研究選用pH值為8.0作為最適pH值,在該pH值下酶解,初始pH值調(diào)節(jié)時(shí)堿的消耗量小,反應(yīng)結(jié)束時(shí)pH值已降至中性,不需再用HCl中和,產(chǎn)品鹽分含量較低,無(wú)需進(jìn)行脫鹽.

圖4 pH值對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、水解度和收率的影響Fig.4 Effect of pH on DPPH radical scavenging ability, degree of hydrolysis,and yield

2.5 底物濃度對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、收率與水解度的影響

底物濃度對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、收率與水解度的影響如圖5.由圖5可見(jiàn),底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)從6%增至8%時(shí),DPPH自由基清除率顯著下降;但繼續(xù)增大底物濃度,DPPH自由基清除率變化不再顯著.增大底物濃度對(duì)水解度沒(méi)有顯著影響,但卻導(dǎo)致花生肽的收率顯著下降.底物濃度較低時(shí),雖然DPPH自由基清除率和收率較高,但單位設(shè)備容積的投料量少,生產(chǎn)效率低.綜合考慮產(chǎn)品DPPH自由基清除率、收率和生產(chǎn)效率,宜選擇10%為較佳底物濃度.

圖5 底物濃度對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率、水解度和收率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on DPPH radical scavenging ability,degree of hydrolysis,and yield

2.6 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2.經(jīng)過(guò)Design Expert7.1軟件,分析后得出,DPPH自由基清除率Y1和收率Y2對(duì)溫度(X1)、pH(X2)和底物濃度(X3)3個(gè)因素的回歸方程,見(jiàn)式(5)、式(6).

式(5)、式(6)中,Y1為DPPH自由基清除率,%;Y2為收率,%;X1、X2、X3為自變量的編碼值.

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of Box-Behnken experiments

對(duì)兩個(gè)回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可知,DPPH自由基清除率和收率的兩個(gè)回歸模型均高度顯著(P＜0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05),兩個(gè)模型的決定系數(shù)R2分別為0.924 4和0.900 6,表明響應(yīng)值的變化分別有 92.44%和90.06%來(lái)源于所選變量,說(shuō)明模型能夠很好地描述與預(yù)測(cè)花生粕的酶解過(guò)程.從模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可以看出,模型的一次項(xiàng)X2對(duì)DPPH自由基清除率的影響極顯著(P＜0.01),一次項(xiàng)X3、交互項(xiàng)X1X2和二次項(xiàng)X22、X23對(duì) DPPH自由基清除率的影響顯著(P＜0.05),其余各項(xiàng)對(duì)DPPH自由基清除率的影響不顯著(P＞0.05);一次項(xiàng)X1和X3對(duì)收率的影響極顯著(P＜0.01),一次項(xiàng)X2對(duì)收率的影響顯著(P＜0.05),其余各項(xiàng)對(duì)收率的影響不顯著(P＞0.05).用Design Expert 7.1軟件繪制溫度與pH值對(duì)DPPH自由基清除率和收率交互影響的響應(yīng)面圖,如圖6.將DPPH自由基清除率和收率同時(shí)設(shè)為最大值進(jìn)行優(yōu)化求解,模型預(yù)測(cè)的3個(gè)因素的編碼值分別為X1=-1.0、X2=0.32、X3=-0.83,與其對(duì)應(yīng)的真實(shí)值分別為溫度50℃,pH值8.54,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.34%.在此優(yōu)化條件下,DPPH自由基清除率的理論最大值為28.34%,收率的理論最大值為65.49%.為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可行性,在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,DPPH自由基清除率的真實(shí)值為25.77%±0.57%,收率的真實(shí)值為65.80% ±0.46%,均與理論最大值相差較小,說(shuō)明兩個(gè)模型是合適的.

表3 二次回歸模型的回歸分析結(jié)果Tab.3 Regression analysis results of quadraticregression models

圖6 溫度和pH值對(duì)花生肽的DPPH自由基清除率與收率影響的響應(yīng)面分析結(jié)果Fig.6 Response surface analysis of influence of temperature and pH on DPPH radical scavenging ability and yield

3 結(jié) 論

花生肽的抗氧化性受蛋白酶的種類、水解溫度、pH值、底物濃度、酶底比(E/S)和水解時(shí)間等工藝條件的影響,優(yōu)化工藝條件可顯著提高花生肽的抗氧化性.以DPPH自由基清除率和收率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合酶法水解花生粕生產(chǎn)抗氧化性肽的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,研究結(jié)果表明,堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)花生粕具有較強(qiáng)的水解能力,二者以2∶1的比例對(duì)花生粕水解時(shí),較優(yōu)水解條件是50℃,pH值為8.54,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.34%.在此條件下酶解16 h,花生肽的收率為65.80%,在花生肽質(zhì)量濃度為0.55mg/m L時(shí),對(duì)DPPH自由基清除率為25.77%,與優(yōu)化前相比,復(fù)合酶比堿性蛋白酶單酶水解時(shí)收率和自由基清除率分別提高了7.48%和7.66%,比中性蛋白酶單酶水解時(shí)分別提高了10.29%和22.53%.花生肽的抗氧化性與水解度有關(guān),但并不是水解度越高抗氧化性越強(qiáng),水解過(guò)程宜以抗氧化能力作為主要控制指標(biāo),而不是簡(jiǎn)單地提高水解度.水解溫度與pH值對(duì)花生肽的抗氧化性存在交互影響,Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法可以充分闡釋這種交互作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,適用于對(duì)花生粕酶解過(guò)程的優(yōu)化.

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Optim ization of Processing of Antioxidant Peptides from Peanut M eal using Com pound Enzymes

LIU Hongmei1, SHIGuangbo1, LIXiangdong2, SUN Zhongtao1,*
(1.College of Life Science,Shandong Agricultural University,Tai'an 271018,China;
2.College of Agronomy,Shandong Agricultural University,Tai'an 271018,China)

With the DPPH radical scavenging ability and yield of peanut peptides as response values,the Box-Behnken experimentswere carried out to optimize the production conditions of antioxidant peptides from peanutmeal using compound enzymes.Results proved thatalcalase and neutrase showed the highest hydrolysis ability compared with other commercial proteases.The optimal hydrolysis conditions were 50 ℃,pH 8.54,and substrate concentration 8.34%when alcalase and neutrasewere adopted togetherwith a ratio of2 to 1.When peanutmealwas hydrolyzed for 16 h under the optimal conditions,the yield of peanut peptides reached 65.80%and the DPPH radicalscavenging ability of the peanut peptides solution with a concentration of 0.55mg/m L reached 25.77%,The yield and DPPH radical scavenging ability of peanut peptidesobtained using compound enzymeswere7.48%and 7.66%higher than these of peptides obtained using alcalase and 10.29%and 22.53%higher than these of peptides obtained using neutrase.

alcalase;neutrase;peanut peptides;antioxidant activity

葉紅波)

TS229

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.03.011

2095-6002(2014)03-0059-06

劉紅梅,師廣波,李向東,等.復(fù)合酶法水解花生粕制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2014,32(3):59-64. LIU Hongmei,SHIGuangbo,LI Xiangdong,et al.Optimization of processing of antioxidant peptides from peanutmeal using compound enzymes.Journal of Food Science and Technology,2014,32(3):59-64.

2013-10-16

劉紅梅,女,碩士研究生,研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程與酶工程;*孫中濤,男,副教授,博士,主要從事發(fā)酵工程與酶工程方面的研究.通訊作者.