董 征, 孫雪冬, 滿秋紅, 姚 波, 李玉芳, 劉鐵強(qiáng), 黃 珊, 劉廣賢, 艾輝勝, 郭 梅

(解放軍307醫(yī)院, 北京 100071)

nm23-M1基因在小鼠粒單核細(xì)胞白血病中的表達(dá)

董 征, 孫雪冬, 滿秋紅, 姚 波, 李玉芳, 劉鐵強(qiáng), 黃 珊, 劉廣賢, 艾輝勝, 郭 梅

(解放軍307醫(yī)院, 北京 100071)

目的 探討nm23-M1基因在小鼠粒單核細(xì)胞白血病中的表達(dá)。方法 給小鼠經(jīng)尾靜脈注射粒單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株WEHI-3,同時(shí)選取正常小鼠作為對(duì)照組，取發(fā)病小鼠以及正常小鼠的骨髓,采取qRT-PCR的方法檢測(cè)nm23-M1基因的表達(dá)情況，分析其與白血病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果 粒單細(xì)胞白血病小鼠骨髓細(xì)胞中nm23-M1基因的相對(duì)表達(dá)量是正常對(duì)照組中的24倍,兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論 nm23-M1基因在小鼠粒單核細(xì)胞白血病中高表達(dá),并且與外周血白細(xì)胞數(shù)、骨髓原始細(xì)胞數(shù)以及臟器白血病侵襲情況相關(guān)，而與白血病小鼠的性別、年齡無(wú)關(guān)。

nm23-M 1基因; 粒單核細(xì)胞白血病

分化抑制因子nm23基因最先由美國(guó)國(guó)立癌癥研究院Steeg等[1]于1988年將輕度和高度轉(zhuǎn)移黑色素瘤細(xì)胞的cDNA文庫(kù)進(jìn)行差異雜交后發(fā)現(xiàn)。人類(lèi)nm23基因有nm23-H1和nm23-H2兩種亞型，兩者具有88%的氨基酸序列同源性，兩基因都定位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶同一區(qū)域，呈串聯(lián)排列[2]。而鼠類(lèi)的nm23-M 1基因定位于11號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶, 與人類(lèi)nm23-H1有98%的同源性, 和nm23-H2有88%的同源性。nm23基因在正常細(xì)胞和血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化中都起了重要作用[3～5]。nm23基因抑制了多種白血病細(xì)胞的分化如:小鼠的髓系白血病M 1、WEHI-3以及人類(lèi)白血病HEL,KU812,K562[6]。而nm23-M 1基因在白血病小鼠體內(nèi)的表達(dá)研究甚少。本文主要研究nm23-M 1基因在WEHI-3白血病小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況，分析其與疾病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

選用6～8周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠40只雌雄各半，體質(zhì)量20±1 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(軍)2007-004]) 。小鼠粒單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株WEHI-3 購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心。逆轉(zhuǎn)錄體系及PCR 擴(kuò)增體系(日本TaKaRa 公司產(chǎn)品), 基因引物及探針均由日本TaKaRa公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀MX3005P為美國(guó)Stratagene公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

BALB/c小鼠分為2組，一組正常小鼠作為對(duì)照組，另一組為白血病小鼠經(jīng)由尾靜脈接種1×106個(gè)WEHI-3 細(xì)胞，在接種后2周，脫臼處死小鼠提取骨髓組織進(jìn)行檢測(cè)。注射后觀察小鼠飲食體質(zhì)量、毛色、活動(dòng)度等一般指標(biāo)，對(duì)瀕死小鼠進(jìn)行血常規(guī)、骨髓涂片、病理組織檢測(cè)以驗(yàn)證白血病小鼠模型的可靠性。

1.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞總RNA的提取

取白血病小鼠和正常小鼠的骨髓樣品。用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心洗滌后得單個(gè)核細(xì)胞，TRIzol法裂解細(xì)胞，提取總RNA，DEPC水溶解，分光光度計(jì)測(cè)OD值在1.8～2.0 ，用TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣本cDNA的制備

取DEPC處理過(guò)的PCR管，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，1μl Oligol隨機(jī)引物加5 ng～2 μg的RNA模板，用無(wú)RNA酶的水補(bǔ)足到10 μl，70℃溫育5 min后置于冰上，依次加入5μl緩沖液，8μl dNTP，1 μl RNA酶抑制劑，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃溫育1 h。cDNA標(biāo)本放置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物及探針的序列和長(zhǎng)度

1.5 引物和探針的設(shè)計(jì)

Genbank查閱各個(gè)基因序列，在基因跨內(nèi)含子區(qū)域應(yīng)用Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)立上下游引物和探針，之后在NCBI網(wǎng)絡(luò)上用BlastResearch分析其特異性(表1)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

采用美國(guó)STRATAGENE公司生產(chǎn)的MX3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR的擴(kuò)增及結(jié)果分析。反應(yīng)體系25 μl，含10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTPs 2.5 μl, 上下游引物2 μl, ddH2O16.5 μl, 探針0.3 μl，HOTSTART TagDNA多聚酶0.125 μl(TAKARA)及模板1 μl。將上述試劑加入0.25 m l的PCR管中，輕彈混勻，短暫離心后進(jìn)行擴(kuò)增。運(yùn)行參數(shù): 95℃ 預(yù)變性10 min; 95℃ 變性30s，59℃退火30 s, 72℃延伸30 s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，在每一個(gè)循環(huán)的退火溫度時(shí)搜集熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳驗(yàn)證目的條帶，并進(jìn)一步將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到T 載體，然后轉(zhuǎn)化E．Coli DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，然后進(jìn)行10倍序列的稀釋?zhuān)瑯?gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)計(jì)算出基因拷貝數(shù)，根據(jù)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法推算出各基因表達(dá)率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。白血病組與對(duì)照組的nm23-M 1基因表達(dá)差異為定量資料,應(yīng)用One-Way ANOVA 進(jìn)行檢驗(yàn), 方差齊性檢驗(yàn)不齊, 選用Dunnett，ST3 法進(jìn)行比較。nm23-M 1 基因表達(dá)水平、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板量、體質(zhì)量之間的相關(guān)性應(yīng)用Spearman相關(guān)分析; 所有分析均設(shè)定P值為雙側(cè)分布, 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR可靠性驗(yàn)證

選取目的基因質(zhì)粒10倍稀釋后，分別將107，106，105，104，103，102的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，證明循環(huán)閾值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的LOG值呈線性相關(guān)。目的基因與管家基因β-actin差值較小，表明擴(kuò)增效率一致性好(圖1)。

2.2 nm23-M 1在白血病組小鼠和正常對(duì)照組小鼠

體內(nèi)表達(dá)的定性檢測(cè)

取兩只白血病小鼠和兩只正常小鼠的骨髓, 提取RNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增, L1、L2代表白血病小鼠，N1、N2代表正常小鼠。結(jié)果顯示白血病小鼠和正常小鼠均表達(dá)nm23-M 1基因，但是熒光強(qiáng)度不同，提示nm23-M 1在白血病小鼠中高表達(dá)(圖2)。

2.3 nm23-M 1在白血病組小鼠和正常對(duì)照小鼠體

內(nèi)表達(dá)的熒光相對(duì)定量檢測(cè)

圖1 nm23-M 1基因質(zhì)粒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖2 nm23-M 1在正常和白血病小鼠中的表達(dá)情況

擴(kuò)增效率(E)由等式E=10(-1/斜率)計(jì)算得出。△Ct是指參照標(biāo)本與待測(cè)標(biāo)本的Ct值差異。兩組之間進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組nm23-M 1相對(duì)表達(dá)量(2.05±1.26)比較, 白血病組nm23-M 1基因表達(dá)(48.73±64.31)顯著升高(P＜0.05)。證明nm23-M 1基因表達(dá)的高低與白血病疾病是相關(guān)的。

2.4 白血病小鼠中nm23-M 1基因的表達(dá)情況與其他因素的相關(guān)性

nm23-M 1基因與外周血白細(xì)胞數(shù)、骨髓原始細(xì)胞數(shù)以及臟器白血病侵襲情況相關(guān)，而與白血病小鼠的性別、年齡無(wú)關(guān)(表3)。

3 討論

研究表明，nm-23基因與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化密切相關(guān)。但nm23基因在人類(lèi)不同類(lèi)型的腫瘤中有著不同的功能[7～10]。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，包括AML，ALL，MDS, CML, 淋巴瘤, nm23-H1基因均有表達(dá)，并且有研究顯示其可以作為預(yù)后的標(biāo)志[11～13]。在對(duì)110個(gè)AML患者的nm23基因的表達(dá)情況與臨床各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析中，nm23-H1的表達(dá)增加會(huì)增加初始化療的耐藥性并使總的存活率降低[14]。所以，在AML患者中nm23-H1是個(gè)重要的預(yù)后指標(biāo)。隨著近年來(lái)對(duì)小鼠白血病模型的建立，研究更加深入，但基因方面的研究較少。

在本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了20只粒單細(xì)胞白血病小鼠骨髓細(xì)胞中nm23-M 1基因的相對(duì)表達(dá)量均值是正常對(duì)照組中20只小鼠骨髓中nm23-M 1基因的相對(duì)表達(dá)量的均值的24倍，兩組之間有顯著差異。結(jié)果表明nm23-M 1的表達(dá)增高與小鼠粒單細(xì)胞白血病相關(guān)。因?yàn)閚m23-M 1基因在一些人類(lèi)的實(shí)體腫瘤以及血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的表達(dá)與腫瘤的高轉(zhuǎn)移性和侵襲性相關(guān)，作者考慮nm23-M 1基因的表達(dá)可能與腫瘤本身的一些特性有關(guān)，所以將nm23-M 1基因的表達(dá)與粒單細(xì)胞白血病小鼠的性別、年齡、外周血白細(xì)胞數(shù)、骨髓原始細(xì)胞數(shù)以及臟器白血病侵襲情況做了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示nm23-M 1基因與外周血白細(xì)胞數(shù)、骨髓原始細(xì)胞數(shù)以及臟器白血病侵襲情況相關(guān)，而與白血病小鼠的性別、年齡無(wú)關(guān)。因?yàn)榘籽”旧淼奶匦?，骨髓中白血病?xì)胞不斷增殖，抑制其他血細(xì)胞增殖，越到疾病晚期外周血中白細(xì)胞數(shù)目增高越明顯，骨髓中白血病細(xì)胞比例越高，并且通過(guò)血液系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到其它臟器中。綜上考慮，nm23-M 1在粒單細(xì)胞白血病小鼠中的表達(dá)與那些能反應(yīng)白血病惡性程度、白血病侵襲情況相關(guān)。而當(dāng)小鼠體內(nèi)存在少量白血病細(xì)胞不足以發(fā)病的時(shí)候，nm23-M 1基因表達(dá)不增高，所以不能作為殘留白血病的標(biāo)志。在小鼠發(fā)病以后，nm23-M 1基因表達(dá)增高可以作為一個(gè)輔助診斷小鼠粒單白血病的標(biāo)志和判斷預(yù)后的標(biāo)志。

表3 nm23-M 1表達(dá)與臨床各因素相關(guān)性統(tǒng)計(jì)表

[參考文獻(xiàn)]

[1] Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated w ith low tumor metastatic potential[J]. J Natl Cancer Inst, 1988,80(3):200-204.

[2] Chandrasekharappa SC, Gross LA, King SE, et al.The human NME2 gene lies w ithin 18kb of NME1 in chrosome 17[J]. Gene Chromosomes Cancer, 1993, 6(4):245-248.

[3] Smagghe BJ, Stewart AK, Carter MG, et al. MUC1*Ligand, NM 23-H1, is a novel grow th factor that maintains human stem cells in a more naive state[J]. PLoS One，2013,8(3): e58601.

[4] Okabe-Kado J, Kasukabe T, Kaneko Y. Extracellular NM 23 protein as a therapeutic target for hematologic malignancies [J]. Adv Hematol, 2012:879368.

[5] Joosten M, Blazquez-Dom ingo M, Lindeboom F, et al. Translational control of putative protooncogene Nm23-M 2 by cytokines via phosphoinositide 3-kinase signaling[J]. J Biol Chem, 2004, 279(37):38169-38176.

[6] Okabe-Kado J, Kasukabe T, Honma Y. Differentiation inhibitory factor Nm23 as a prognostic factor for acute myeloid leukem ia[J]. Leuk Lymphoma, 1998, 32(1-2):19-28.

[7] An R, M eng J, Shi Q, et al. Expressions of nucleoside diphosphate kinase (nm23) in tumor tissues are related w ith metastasis and length of survival of patients w ith hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Environ Sci, 2010, 23(4):267-272.

[8] Andolfo I, De Martino D, Liguori L, et al. Correlation of NM 23-H1 cytoplasm ic expression w ith metastatic stage in human prostate cancer tissue[J]. Naunyn Schm iedebergs Arch Pharmacol, 2011, 384(4-5):489-498.

[9] Liu C, Liu J, Wang X, et al. Prognostic impact of nm23-H1 and PCNA expression in pathologic stage I non-small cell lung cancer[J]. J Surg Oncol, 2011, 104(2):181-186.

[10] Boissan M, De Wever O, Lizarraga F, et al. Implication of metastasis suppressor NM 23-H1 in maintaining adherens junctions and lim iting the invasive potential of human cancer cells[J]. Cancer Res, 2010, 70(19):7710-7722.

[11] Lilly AJ, Khanim FL, Hayden RE, et al. Nm23-h1 indirectly promotes the survival of acute myeloid leukem ia blast cells by binding to more mature components of the leukemic clone [J]. Cancer Res, 2011, 71(3):1177-1186.

[12] Niitsu N, Nakam ine H, Okamoto M. Expression of nm23-H1 is associated w ith poor prognosis in peripheral T-cell lym phoma, not otherw ise specified[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(9):2893-2899.

[13] Niitsu N, Tamaru J, Yoshino T, et al. A study on nm23-H1 expression in diffuse large B-cell lymphoma that was treated w ith CyclOBEAP plus rituximab therapy[J]. Ann Hematol, 2011, 90(2):185-192.

[14] Yokoyama A, Okabe-Kado J, Wakimoto N, et al. Evaluation by multivariate analysis of the differentiation inhibitory factor nm23 as a prognostic factor in acute myelogenous leukem ia and application to other hematologic malignancies [J]. Blood, 1998, 91(6):1845-1851.

Expression of nm23-M1 Gene in Mouse Myelomonocytic Leukemia

DONG Zheng, SUN Xue-dong, MAN Qiu-hong,YAO Bo, LI Yu-fang, LIU Tie-qiang, HUANG Shan, LIU Gguang-xian, AiHui-sheng, GUO Mei
(307 Hospital of PLA, Beijing 100071, China)

ObjectiveTo investigate the expression level of nm23-M 1 gene in mouse myelomonocytic leukemia.M ethodsThe mice were inoculated intravenously w ith myelomonocytic leukemia cells of WEHI-3 cells, and selected a control group of normal mice. Bone marrow samples were collected in two groups. The nm23-M 1 mRNA expression were detected by TaqMan quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR) and analysis of its relationship w ith the occurrence and development of leukemia. ResultsThe expression of nm23-M 1 gene in bone marrow cells of mice w ith leukemia is 24 times of the normal control group. There was a significant difference between the two groups (P＜0.05).ConclusionThe nm23-M 1 gene overexpressed .in mouse myelomonocytic leukemia, and had close relationship between and peripheral white blood cell count, the number of original cells in bone marrow and organ against the leukemia cases, regardless of the gender, age and leukemia in mice.

nm23-M 1 gene; Myelomonocytic leukemia

Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0042-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.06.008

2013-06-03

董 征(1983-), 男, 醫(yī)師, 解放軍307醫(yī)院血液內(nèi)科, E-mail: dongz1983@139.com

郭 梅, 副主任醫(yī)師, 解放軍307醫(yī)院血液內(nèi)科, E-mail: guomei307@163.com