喬 明, 劉蘭英, 王和生

(1. 南京中醫(yī)藥大學, 南京 210000; 2. 江蘇省中醫(yī)院, 南京 210000)

·綜 述·

慢性過敏性哮喘大鼠模型的建立與評價

喬 明1, 劉蘭英2, 王和生2

(1. 南京中醫(yī)藥大學, 南京 210000; 2. 江蘇省中醫(yī)院, 南京 210000)

為制備出接近人類慢性過敏性哮喘特征的大鼠模型提供研究基礎。本文總結國內外近年來慢性過敏性哮喘大鼠模型的建立方法，從模型大鼠品系的選擇、造模方法、模型評價等幾個方面來綜述。

慢性過敏性哮喘 大鼠模型 綜述

哮喘是由多種細胞包括氣道的炎性細胞、結構細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。全世界大約有3億人患哮喘，而且哮喘發(fā)病人數(shù)呈上升趨勢[2]。目前, 人類對哮喘發(fā)病的生理學、免疫學機制尚未明確。由于人體研究存在局限性及倫理學上的限制，對哮喘的研究往往需要通過動物模型來進行。但是，目前大鼠哮喘模型大多是經短時間致敏、激發(fā)而建立的急性模型[3]，往往形成急性氣道炎癥，缺少慢性氣道炎癥及氣道增厚重塑為特征的慢性過敏性哮喘模型, 不能模擬哮喘病人反復接觸過敏原使病情逐漸惡化的過程。近年來, 關于慢性過敏性哮喘大鼠模型的研究越來越多。本文對慢性過敏性哮喘大鼠模型的研究進行綜述, 為制備出接近人類慢性哮喘特征的大鼠模型提供研究基礎。

1 常用大鼠品系

大鼠容易被致敏,易于制作哮喘模型，且大鼠過敏反應與人類哮喘反應特點相似。大鼠過敏反應主要由IgE介導, 激發(fā)后易發(fā)生速發(fā)性與遲發(fā)性雙相反應，遲發(fā)反應出現(xiàn)時間與哮喘患者出現(xiàn)遲發(fā)相反應時間接近, 肺部炎細胞浸潤、Th2增多、INF-γ分泌的減少及產生的氣道高敏持續(xù)時間長[4]。在大鼠哮喘模型中更易獲得分子生物學研究中所需的材料。大鼠被廣泛應用于過敏性哮喘的研究中，但是不同品系之間的大鼠仍存在差異。

1.3.1 BN(Brown-Norway)大鼠 國外關于哮喘研究中多采用BN大鼠，常用于研究藥物對氣道嗜酸粒細胞增多的影響[5]。該品系模型在特異性抗體的產生及誘發(fā)哮喘癥狀上優(yōu)勢明顯，尤其容易引起IgE介導早期過敏反應以及Th2的優(yōu)勢免疫應答[6]。Hylkema等[7]報道，用卵清蛋白(ovalbumin, OVA)分別致敏BN大鼠和SD大鼠，結果發(fā)現(xiàn)BN大鼠中Th2細胞對OVA反應較SD大鼠顯著。但BN大鼠價格較昂貴且獲取較困難，在國內研究中應用較少。

1.3.2 SD大鼠和W istar大鼠 目前國內常用SD大鼠和W istar大鼠來制備哮喘模型，這兩種品系的雌雄大鼠在急、慢性哮喘模型中均有應用。SD與W istar大鼠均為封閉群，遺傳背景均相似, 國內有許多文獻報道采用SD與W istar大鼠均可以成功復制出哮喘模型[8]。SD大鼠對疾病的抵抗力較W istar大鼠為強, 尤其對呼吸道疾病的抵抗力很強[9]。但在相同條件下W istar大鼠比SD大鼠更容易成功復制出哮喘模型[10]。竇迎婷等[11]在制備哮喘動物模型實踐中觀察到，在同樣致敏和激發(fā)條件下，SD與W istar大鼠在哮喘癥狀表現(xiàn)上、外周血和肺泡灌洗液(BALF) 中嗜酸細胞(EOS) 的數(shù)量及肺部嗜酸細胞浸潤的病理表現(xiàn)上與對照組相比未見明顯差異。

2 模型建立方法

OVA是目前支氣管哮喘動物模型中使用最廣泛的致敏原[12]。OVA致敏和激發(fā)是制作哮喘模型的兩個主要步驟，基本方法是腹腔或皮下注射OVA (含或不含佐劑)致敏，OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)。慢性哮喘模型的建立方法與急性哮喘模型比較, 主要區(qū)別在于采用較低濃度長時間的反復激發(fā)。

2.1 造模周期

造模周期由過敏反應的兩個階段決定，即致敏階段和激發(fā)階段。致敏階段即初次接觸抗原，一般需潛伏1～2周才能產生相應的抗體或致敏淋巴細胞，從而具備發(fā)生變態(tài)反應的能力。激發(fā)階段即當相同抗原再次刺激機體時，抗原與抗體反應引起機體損傷。

2.1.1 致敏階段 慢性哮喘大鼠模型致敏周期一般為2周, 在第1、8日分別進行2次。Palmans等[13]用BN大鼠于實驗第1、8日每只腹腔內注射0.5 m l生理鹽水混合液[含OVA 1 mg+Al(OH)3200 μg]致敏,共2周。魏兵等[14]在研究建立慢性過敏性哮喘的動物模型實驗中以OVA懸液1 m l[含OVA 100 mg + Al (OH)3100 mg]在第1、8日致敏SD大鼠，2周后激發(fā)。羅俊明等[15]于第1、8日在SD大鼠雙上肢內側、雙下肢大腿外側及腹腔注射1 m l 混懸液[含OVA 1 mg+ Al(OH)3100 mg ], 其中皮下共注射0.4 m l、腹腔注射0.6m l，2周后激發(fā)。

2.1.2 激發(fā)階段 在末次致敏后一周進行激發(fā)，激發(fā)的時間長短差異較大，慢性哮喘模型激發(fā)所需的時間一般都在4周以上。李惠民等[16]在研究慢性哮喘的動態(tài)模型過程中從第1 5日起霧化吸入1%OVA，3次/周，每次20 m in，分別建立24 h模型、1周模型、2周模以及4周模型。研究發(fā)現(xiàn),隨過敏原激發(fā)次數(shù)的增多, 支氣管上皮的損傷和破壞逐漸加重, 同時反映了哮喘時支氣管上皮損傷、脫落和異常修復的過程。Yang等[17]在第15日，向置于密閉有機玻璃容器內的大鼠噴霧1% OVA，隔日一次，每次30 min, 持續(xù)8周。Palmans等[13]以1%OVA每次霧化30 min，3次/周激發(fā)BN大鼠制作2周、4周、12周的模型，發(fā)現(xiàn)4周的模型大鼠肺組織嗜酸粒細胞浸潤及血清IgE達到峰值。而氣道高反應性則會在激發(fā)至少6周后出現(xiàn)[18]。

2.2 過敏原的用量

OVA作為目前使用最廣泛的致敏原，由于其OVA純度以及大鼠品種的不同，造成實驗中用量有很大差異。文獻報道，大約39.8%的文章使用1 mg OVA、21.1%使用10 mg OVA、31.9%使用100 mg OVA致敏[19]。Palmans等[13]以含1 mg OVA和200 μg A l(OH)3混合液0.5 m l腹腔內注射致敏，1%OVA霧化30 min建立慢性哮喘模型。XIE[20]等用含10 mg OVA和200 mg Al(OH)3的生理鹽水1 m l,同時腹腔注射百日咳桿菌疫苗6×109個菌株致敏，2% OVA的生理鹽水激發(fā)。Jin等[21]腹腔內注射1 m l生理鹽水配置的含100 mg OVA和100 mg AL(OH)3混合液，第15日起每日用1%OVA激發(fā)建立慢性哮喘模型。孟鵬飛等[8]認為實驗中采用較高純度的OVA(Grade V)致敏, 而用低純度的OVA(Grade Ⅱ)激發(fā)較為合適。

3 慢性哮喘模型的評價

全面成功地評價一個與臨床發(fā)病機制相似的穩(wěn)定可靠的慢性哮喘模型非常重要, 目前對慢性哮喘大鼠模型是否成功缺乏規(guī)范化的統(tǒng)一標準要求。一般認為動物模型是否成功可以通過以下方面說明問題。

3.1 大鼠行為學

慢性哮喘模型大鼠較正常鼠體質量增長緩慢，并表現(xiàn)為豎毛、毛發(fā)暗淡，倦怠[22]。霧化激發(fā)時大鼠出現(xiàn)典型哮喘樣發(fā)作，表現(xiàn)為呼吸急促，張口喘息，噴嚏，口唇發(fā)紺，前肢縮抬，點頭呼吸，腹部翕動及行動遲緩等，并隨著激發(fā)次數(shù)增加癥狀逐步加重[23～24]。羅俊明等[15]在制備激發(fā)12周的慢性哮喘模型時，以大鼠出現(xiàn)煩躁、搔鼻、呼吸加快、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點頭呼吸及四肢癱軟等表現(xiàn)視為模型制備成功。

3.2 肺組織病理

組織形態(tài)學指標也是評判哮喘模型是否成功的重要指標。哮喘由于急性炎癥反復發(fā)作而轉變?yōu)槁匝装Y，氣道反復損傷與修復, 大量炎性細胞、炎癥介質浸潤并繼發(fā)氣道重塑[16]。因此, 大鼠肺組織病理切片出現(xiàn)炎性細胞浸潤伴有支氣管肺泡腔內滲出增多及支氣管粘膜水腫等氣道重塑改變可表明慢性哮喘大鼠模型已具有哮喘發(fā)作的病理學基礎[25]。

3.2.1 氣道炎癥改變 模型大鼠肺組織HE染色: 肺內支氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤, 管腔狹窄，內可見炎性細胞和滲出物增多, 黏液栓形成[26]。模型大鼠肺組織電鏡下可見纖毛上皮細胞脫落、嗜酸性粒細胞浸潤、胞漿空泡增多、核輕度固縮以及杯狀細胞黏液分泌顆粒增多[16]。這些結果和哮喘病人支氣管黏膜活檢標本支氣管上皮的病理學改變相似。高偉良等[27]發(fā)現(xiàn)模型大鼠激發(fā)4周哮喘組支氣管痙攣、上皮細胞脫落、肺泡隔增厚、支氣管管壁和伴行動脈周圍炎癥細胞浸等病理改變較2周哮喘組更重。

3.2.2 氣道重塑改變 模型大鼠肺組織HE染色: 氣道上皮可見杯狀細胞增生肥厚，支氣管壁明顯增厚，支氣管平滑肌增厚，黏膜下水腫，黏膜皺折增多，可見肺大泡等表現(xiàn)[16～17]。哮喘大鼠掃描電鏡下可見上皮細胞纖毛脫落、排列紊亂、纖毛黏液毯形成、肺泡隔增寬以及纖毛再生現(xiàn)象[28]。王麗新等[23]研究慢性哮喘大鼠模型氣道的重塑的形態(tài)學變化時發(fā)現(xiàn)，激發(fā)2周時杯狀細胞增生明顯, 上皮下可見嗜酸性粒細胞浸潤; 4周時膠原沉積明顯;到6～8周時，氣道壁厚度增厚最明顯。劉中成等[24]觀察到OVA激發(fā)12周的慢性哮喘大鼠模型較1周急性哮喘模型肺泡間隔炎性細胞減少，氣道杯狀細胞增生，平滑肌增厚，纖維化細胞增多等氣道重塑特征明顯加重。

4 結語

慢性哮喘大鼠模型的制作目前沒有統(tǒng)一標準。作者認為制備慢性哮喘大鼠模型時，致敏周期為兩周2次致敏，根據(jù)實驗需要可加用免疫佐劑；激發(fā)的時間應在4周以上方可誘導出典型的慢性哮喘病理改變。評價模型的指標主要為大鼠的典型哮喘樣發(fā)作和肺組織炎性細胞浸潤伴氣道重塑改變等特征性病理學改變。慢性哮喘大鼠模型是進行相關研究的重要基礎，其復制方法仍需在以后的研究中進一步規(guī)范，以期建立哮喘慢性氣道炎癥大鼠模型復制與評價的統(tǒng)一標準。

[1] 中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組.支氣管哮喘防治指南(2008年修訂版)[S].

[2] Broide DH, Finkelman F, Bochner BS, et al. Advances in mechanisms of asthma, allergy, and immunology in 2010[J]. Allergy Clin Immunol 2011; 127: 689-695.

[3] Nials AT, Uddin S. Mouse models of allergic asthma: acute and chronic allergen challenge Disease[J]. Dis Model Mech, 2008, 1:213-220.

[4] Martin JG, Tamaoka M. Rat models of asthma and chronic obstructive lung disease[J]. Pulm Pharmacol Ther, 2006, 19: 377-385.

[5] 崔菲菲, 辛德莉. 支氣管哮喘動物模型現(xiàn)狀[J]. 實驗動物與比較醫(yī)學, 2009, 29(4):277-282.

[6] Ramos-Barbón D, Ludw ig MS, Martin JG, et al. Airway Remodeling : lessons from animal models [J]. Clin Rev Allergy Immunol, 2004, (27):3-21.

[7] Hylkema MN, Hoekstra MO, Luinge M, et al. The strength of the OVA-induced airway inflammation in rats is strain dependent[J]. Clin Exp Immunol, 2002, 129(3):390-396.

[8] 孟鵬飛, 呂越. 簡述用卵蛋白制作大鼠哮喘模型的要點[J].甘肅中醫(yī)學院學報, 2011, 28(2):27-29.

[9] 胡建華, 姚明, 崔淑芳, 等. 實驗動物學教程[M]. 上海: 上?？茖W技術出版社, 2009:71-73.

[10] Kucharew icz I, Anna Bodzenta-kaszyk.Experimental asthma in rats[J]. Pharmacol Rep, 2008, (60):783-788.

[11] 竇迎婷, 劉貴穎. 淺談建立哮喘模型的體會[J]. 江西中醫(yī)學院學報, 2012, 24(2):72-73.

[12] Underwood SL, Haddad E, Birrell MA, et al. Functional characterization and biomarker identification in the Brown Norw ay model of allergic airway inflammation[J]. Br J Pharmacol, 2002, 137(2):263-275.

[13] Palmans E, Kips JC, Pauwels RA, et al. Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats [J]. Am J Respir Crit Care Med, 2000, 161(21):627-635.

[14] 魏兵, 尚云曉, 李淼, 等. 孟魯司特對幼年哮喘氣道重塑大鼠感覺神經肽受體N K 1 R表達的影響[J].中國當代兒科雜志, 2013, 15(4):298-301.

[15] 羅俊明, 況九龍, 顏春松, 等. 丹參對哮喘大鼠氣道重塑的影響[J]. 中國老年學雜志, 2011, 31(9):1587-1590.

[16] 李惠民, 趙順英, 江載芳, 等. 支氣管上皮在大鼠哮喘模型氣道炎癥和重塑中的作用[J].中國實用兒科雜志, 2007, 22 (7):526-529.

[17] Yang YG, Tian WM, Zhang H, et al. Nerve grow th factor exacerbates allergic lung inflammation and airway remodeling in a rat model of chronic asthma[J]. Exp Ther Med, 2013, 6:1251-1258.

[18] Kumar RK, Foster PS. Murine model of chronic human asthma [J].Immunology and Cell Biology, 2001, 79:141-144.

[19] 高云娟, 任遠, 吳國泰, 等. 哮喘動物模型研究現(xiàn)狀分析[J].中藥藥理與臨床, 2012, 28(5):231-234

[20] Xie M, Liu XS, XU YJ, et al. Role of the extracellular signalregulated kinase 1/2 signaling pathw ay in regulating thesecretion of bronchial smooth muscle cells in a rat model of chronic asthma[J]. Chin Med J, 2008, 121(1):73-77.

[21] Jin HL, Luo QL, Zheng YJ, et al. CD4+CD25+Foxp3+T cells contribute to the antiasthmatic effects of Astragalus membranaceus extract in a rat model of asthma[J]. Int Immunopharmacol, 2013, 15:42-49.

[22] Li B, Luo Ql, Mammat N, et al. Establishment and Comparison of Combining Disease and Syndrome Model of Asthma w ith“Kidney Yang Deficiency”and“Abnormal Savda”[J]. Evid Based Complemen Alternat Med, 2013, 10:1-15.

[23] 王麗新, 吳銀根. 實驗性哮喘大鼠氣道重塑的形態(tài)學變化[J].中西醫(yī)結合學報, 2003, 1(1):62-65.

[24] 劉中成, 張艷芬. 一種大鼠慢性哮喘模型的建立與評價[J]. 藥學學報, 2010, 45(6):718-723.

[25] 宮兆華, 董競成, 倪健, 等. 豚鼠支氣管哮喘模型建立[J]. 上海實驗動物科學, 2004, 24(4):204-206.

[26] Yan HU, Liu P, Li HC, et al. The “time-w indow” effect of early allergen exposure on a rat asthma model [J]. Chin Med J, 2013, 126(12):2265-2269.

[27] 高偉良, 邱晨, 袁慶莉, 等. 哮喘大鼠模型氣道重構的病理形態(tài)學改變[J]. 廣東醫(yī)學, 2006, 27(2):176-178.

[28] 朱妍艷, 項薔薇, 羅運春, 等. 姜黃素對哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液和血漿表皮生長因子含量的影響[J]. 免疫學雜志, 2010, 26(11):946-949.

Establishment and Evaluation of Chronic Allergic Asthma Models in Rat

QIAO ming1, LIU Lan-ying2, WANG He-sheng2
(1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China; 2. Jiangsu Province of TCM, Nanjing 210000, China)

To establishment the chronic allergic asthma model, which was similar to chronic human asthma, this paper summarized the rat models of chronic allergic asthma established in recent years, from several aspects such as rat strains, methods, and evaluation of model.

Chronic Allergic Asthma; Rat Models; Review

R-33,Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0079-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.019

2013-10-10

國家自然科學基金(81102632)

喬 明(1991-), 男, 碩士研究生, 研究方向: 針灸, E-mail: 470522236@qq.com

王和生(1965-), 男, 博士, 主任醫(yī)師, 碩士研究生導師, 研究方向: 針灸。E-mail: wanghesheng2007@126.com