喬 明, 劉蘭英, 王和生

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué), 南京 210000; 2. 江蘇省中醫(yī)院, 南京 210000)

·綜 述·

慢性過(guò)敏性哮喘大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

喬 明1, 劉蘭英2, 王和生2

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué), 南京 210000; 2. 江蘇省中醫(yī)院, 南京 210000)

為制備出接近人類慢性過(guò)敏性哮喘特征的大鼠模型提供研究基礎(chǔ)。本文總結(jié)國(guó)內(nèi)外近年來(lái)慢性過(guò)敏性哮喘大鼠模型的建立方法，從模型大鼠品系的選擇、造模方法、模型評(píng)價(jià)等幾個(gè)方面來(lái)綜述。

慢性過(guò)敏性哮喘 大鼠模型 綜述

哮喘是由多種細(xì)胞包括氣道的炎性細(xì)胞、結(jié)構(gòu)細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。全世界大約有3億人患哮喘，而且哮喘發(fā)病人數(shù)呈上升趨勢(shì)[2]。目前, 人類對(duì)哮喘發(fā)病的生理學(xué)、免疫學(xué)機(jī)制尚未明確。由于人體研究存在局限性及倫理學(xué)上的限制，對(duì)哮喘的研究往往需要通過(guò)動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行。但是，目前大鼠哮喘模型大多是經(jīng)短時(shí)間致敏、激發(fā)而建立的急性模型[3]，往往形成急性氣道炎癥，缺少慢性氣道炎癥及氣道增厚重塑為特征的慢性過(guò)敏性哮喘模型, 不能模擬哮喘病人反復(fù)接觸過(guò)敏原使病情逐漸惡化的過(guò)程。近年來(lái), 關(guān)于慢性過(guò)敏性哮喘大鼠模型的研究越來(lái)越多。本文對(duì)慢性過(guò)敏性哮喘大鼠模型的研究進(jìn)行綜述, 為制備出接近人類慢性哮喘特征的大鼠模型提供研究基礎(chǔ)。

1 常用大鼠品系

大鼠容易被致敏,易于制作哮喘模型，且大鼠過(guò)敏反應(yīng)與人類哮喘反應(yīng)特點(diǎn)相似。大鼠過(guò)敏反應(yīng)主要由IgE介導(dǎo), 激發(fā)后易發(fā)生速發(fā)性與遲發(fā)性雙相反應(yīng)，遲發(fā)反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間與哮喘患者出現(xiàn)遲發(fā)相反應(yīng)時(shí)間接近, 肺部炎細(xì)胞浸潤(rùn)、Th2增多、INF-γ分泌的減少及產(chǎn)生的氣道高敏持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)[4]。在大鼠哮喘模型中更易獲得分子生物學(xué)研究中所需的材料。大鼠被廣泛應(yīng)用于過(guò)敏性哮喘的研究中，但是不同品系之間的大鼠仍存在差異。

1.3.1 BN(Brown-Norway)大鼠 國(guó)外關(guān)于哮喘研究中多采用BN大鼠，常用于研究藥物對(duì)氣道嗜酸粒細(xì)胞增多的影響[5]。該品系模型在特異性抗體的產(chǎn)生及誘發(fā)哮喘癥狀上優(yōu)勢(shì)明顯，尤其容易引起IgE介導(dǎo)早期過(guò)敏反應(yīng)以及Th2的優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答[6]。Hylkema等[7]報(bào)道，用卵清蛋白(ovalbumin, OVA)分別致敏BN大鼠和SD大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BN大鼠中Th2細(xì)胞對(duì)OVA反應(yīng)較SD大鼠顯著。但BN大鼠價(jià)格較昂貴且獲取較困難，在國(guó)內(nèi)研究中應(yīng)用較少。

1.3.2 SD大鼠和W istar大鼠 目前國(guó)內(nèi)常用SD大鼠和W istar大鼠來(lái)制備哮喘模型，這兩種品系的雌雄大鼠在急、慢性哮喘模型中均有應(yīng)用。SD與W istar大鼠均為封閉群，遺傳背景均相似, 國(guó)內(nèi)有許多文獻(xiàn)報(bào)道采用SD與W istar大鼠均可以成功復(fù)制出哮喘模型[8]。SD大鼠對(duì)疾病的抵抗力較W istar大鼠為強(qiáng), 尤其對(duì)呼吸道疾病的抵抗力很強(qiáng)[9]。但在相同條件下W istar大鼠比SD大鼠更容易成功復(fù)制出哮喘模型[10]。竇迎婷等[11]在制備哮喘動(dòng)物模型實(shí)踐中觀察到，在同樣致敏和激發(fā)條件下，SD與W istar大鼠在哮喘癥狀表現(xiàn)上、外周血和肺泡灌洗液(BALF) 中嗜酸細(xì)胞(EOS) 的數(shù)量及肺部嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)的病理表現(xiàn)上與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差異。

2 模型建立方法

OVA是目前支氣管哮喘動(dòng)物模型中使用最廣泛的致敏原[12]。OVA致敏和激發(fā)是制作哮喘模型的兩個(gè)主要步驟，基本方法是腹腔或皮下注射OVA (含或不含佐劑)致敏，OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)。慢性哮喘模型的建立方法與急性哮喘模型比較, 主要區(qū)別在于采用較低濃度長(zhǎng)時(shí)間的反復(fù)激發(fā)。

2.1 造模周期

造模周期由過(guò)敏反應(yīng)的兩個(gè)階段決定，即致敏階段和激發(fā)階段。致敏階段即初次接觸抗原，一般需潛伏1～2周才能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞，從而具備發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的能力。激發(fā)階段即當(dāng)相同抗原再次刺激機(jī)體時(shí)，抗原與抗體反應(yīng)引起機(jī)體損傷。

2.1.1 致敏階段 慢性哮喘大鼠模型致敏周期一般為2周, 在第1、8日分別進(jìn)行2次。Palmans等[13]用BN大鼠于實(shí)驗(yàn)第1、8日每只腹腔內(nèi)注射0.5 m l生理鹽水混合液[含OVA 1 mg+Al(OH)3200 μg]致敏,共2周。魏兵等[14]在研究建立慢性過(guò)敏性哮喘的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中以O(shè)VA懸液1 m l[含OVA 100 mg + Al (OH)3100 mg]在第1、8日致敏SD大鼠，2周后激發(fā)。羅俊明等[15]于第1、8日在SD大鼠雙上肢內(nèi)側(cè)、雙下肢大腿外側(cè)及腹腔注射1 m l 混懸液[含OVA 1 mg+ Al(OH)3100 mg ], 其中皮下共注射0.4 m l、腹腔注射0.6m l，2周后激發(fā)。

2.1.2 激發(fā)階段 在末次致敏后一周進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)的時(shí)間長(zhǎng)短差異較大，慢性哮喘模型激發(fā)所需的時(shí)間一般都在4周以上。李惠民等[16]在研究慢性哮喘的動(dòng)態(tài)模型過(guò)程中從第1 5日起霧化吸入1%OVA，3次/周，每次20 m in，分別建立24 h模型、1周模型、2周模以及4周模型。研究發(fā)現(xiàn),隨過(guò)敏原激發(fā)次數(shù)的增多, 支氣管上皮的損傷和破壞逐漸加重, 同時(shí)反映了哮喘時(shí)支氣管上皮損傷、脫落和異常修復(fù)的過(guò)程。Yang等[17]在第15日，向置于密閉有機(jī)玻璃容器內(nèi)的大鼠噴霧1% OVA，隔日一次，每次30 min, 持續(xù)8周。Palmans等[13]以1%OVA每次霧化30 min，3次/周激發(fā)BN大鼠制作2周、4周、12周的模型，發(fā)現(xiàn)4周的模型大鼠肺組織嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)及血清IgE達(dá)到峰值。而氣道高反應(yīng)性則會(huì)在激發(fā)至少6周后出現(xiàn)[18]。

2.2 過(guò)敏原的用量

OVA作為目前使用最廣泛的致敏原，由于其OVA純度以及大鼠品種的不同，造成實(shí)驗(yàn)中用量有很大差異。文獻(xiàn)報(bào)道，大約39.8%的文章使用1 mg OVA、21.1%使用10 mg OVA、31.9%使用100 mg OVA致敏[19]。Palmans等[13]以含1 mg OVA和200 μg A l(OH)3混合液0.5 m l腹腔內(nèi)注射致敏，1%OVA霧化30 min建立慢性哮喘模型。XIE[20]等用含10 mg OVA和200 mg Al(OH)3的生理鹽水1 m l,同時(shí)腹腔注射百日咳桿菌疫苗6×109個(gè)菌株致敏，2% OVA的生理鹽水激發(fā)。Jin等[21]腹腔內(nèi)注射1 m l生理鹽水配置的含100 mg OVA和100 mg AL(OH)3混合液，第15日起每日用1%OVA激發(fā)建立慢性哮喘模型。孟鵬飛等[8]認(rèn)為實(shí)驗(yàn)中采用較高純度的OVA(Grade V)致敏, 而用低純度的OVA(Grade Ⅱ)激發(fā)較為合適。

3 慢性哮喘模型的評(píng)價(jià)

全面成功地評(píng)價(jià)一個(gè)與臨床發(fā)病機(jī)制相似的穩(wěn)定可靠的慢性哮喘模型非常重要, 目前對(duì)慢性哮喘大鼠模型是否成功缺乏規(guī)范化的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)要求。一般認(rèn)為動(dòng)物模型是否成功可以通過(guò)以下方面說(shuō)明問(wèn)題。

3.1 大鼠行為學(xué)

慢性哮喘模型大鼠較正常鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，并表現(xiàn)為豎毛、毛發(fā)暗淡，倦怠[22]。霧化激發(fā)時(shí)大鼠出現(xiàn)典型哮喘樣發(fā)作，表現(xiàn)為呼吸急促，張口喘息，噴嚏，口唇發(fā)紺，前肢縮抬，點(diǎn)頭呼吸，腹部翕動(dòng)及行動(dòng)遲緩等，并隨著激發(fā)次數(shù)增加癥狀逐步加重[23～24]。羅俊明等[15]在制備激發(fā)12周的慢性哮喘模型時(shí)，以大鼠出現(xiàn)煩躁、搔鼻、呼吸加快、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點(diǎn)頭呼吸及四肢癱軟等表現(xiàn)視為模型制備成功。

3.2 肺組織病理

組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)也是評(píng)判哮喘模型是否成功的重要指標(biāo)。哮喘由于急性炎癥反復(fù)發(fā)作而轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y，氣道反復(fù)損傷與修復(fù), 大量炎性細(xì)胞、炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)并繼發(fā)氣道重塑[16]。因此, 大鼠肺組織病理切片出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)伴有支氣管肺泡腔內(nèi)滲出增多及支氣管粘膜水腫等氣道重塑改變可表明慢性哮喘大鼠模型已具有哮喘發(fā)作的病理學(xué)基礎(chǔ)[25]。

3.2.1 氣道炎癥改變 模型大鼠肺組織HE染色: 肺內(nèi)支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 管腔狹窄，內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞和滲出物增多, 黏液栓形成[26]。模型大鼠肺組織電鏡下可見(jiàn)纖毛上皮細(xì)胞脫落、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、胞漿空泡增多、核輕度固縮以及杯狀細(xì)胞黏液分泌顆粒增多[16]。這些結(jié)果和哮喘病人支氣管黏膜活檢標(biāo)本支氣管上皮的病理學(xué)改變相似。高偉良等[27]發(fā)現(xiàn)模型大鼠激發(fā)4周哮喘組支氣管痙攣、上皮細(xì)胞脫落、肺泡隔增厚、支氣管管壁和伴行動(dòng)脈周圍炎癥細(xì)胞浸等病理改變較2周哮喘組更重。

3.2.2 氣道重塑改變 模型大鼠肺組織HE染色: 氣道上皮可見(jiàn)杯狀細(xì)胞增生肥厚，支氣管壁明顯增厚，支氣管平滑肌增厚，黏膜下水腫，黏膜皺折增多，可見(jiàn)肺大泡等表現(xiàn)[16～17]。哮喘大鼠掃描電鏡下可見(jiàn)上皮細(xì)胞纖毛脫落、排列紊亂、纖毛黏液毯形成、肺泡隔增寬以及纖毛再生現(xiàn)象[28]。王麗新等[23]研究慢性哮喘大鼠模型氣道的重塑的形態(tài)學(xué)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，激發(fā)2周時(shí)杯狀細(xì)胞增生明顯, 上皮下可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn); 4周時(shí)膠原沉積明顯;到6～8周時(shí)，氣道壁厚度增厚最明顯。劉中成等[24]觀察到OVA激發(fā)12周的慢性哮喘大鼠模型較1周急性哮喘模型肺泡間隔炎性細(xì)胞減少，氣道杯狀細(xì)胞增生，平滑肌增厚，纖維化細(xì)胞增多等氣道重塑特征明顯加重。

4 結(jié)語(yǔ)

慢性哮喘大鼠模型的制作目前沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。作者認(rèn)為制備慢性哮喘大鼠模型時(shí)，致敏周期為兩周2次致敏，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可加用免疫佐劑；激發(fā)的時(shí)間應(yīng)在4周以上方可誘導(dǎo)出典型的慢性哮喘病理改變。評(píng)價(jià)模型的指標(biāo)主要為大鼠的典型哮喘樣發(fā)作和肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)伴氣道重塑改變等特征性病理學(xué)改變。慢性哮喘大鼠模型是進(jìn)行相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)，其復(fù)制方法仍需在以后的研究中進(jìn)一步規(guī)范，以期建立哮喘慢性氣道炎癥大鼠模型復(fù)制與評(píng)價(jià)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

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Establishment and Evaluation of Chronic Allergic Asthma Models in Rat

QIAO ming1, LIU Lan-ying2, WANG He-sheng2
(1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China; 2. Jiangsu Province of TCM, Nanjing 210000, China)

To establishment the chronic allergic asthma model, which was similar to chronic human asthma, this paper summarized the rat models of chronic allergic asthma established in recent years, from several aspects such as rat strains, methods, and evaluation of model.

Chronic Allergic Asthma; Rat Models; Review

R-33,Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0079-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.019

2013-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金(81102632)

喬 明(1991-), 男, 碩士研究生, 研究方向: 針灸, E-mail: 470522236@qq.com

王和生(1965-), 男, 博士, 主任醫(yī)師, 碩士研究生導(dǎo)師, 研究方向: 針灸。E-mail: wanghesheng2007@126.com