林 顥，劉 軍，魏 波，曾 榮，王培永，向 昊，郭偉雄，祝兆波

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，廣東湛江524001）

股骨頭缺血性壞死是糖皮質(zhì)激素應(yīng)用過程中潛在的常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一［1-2］。文獻(xiàn)及臨床經(jīng)驗(yàn)證實(shí)糖皮質(zhì)激素引起的骨壞死是在病理上表現(xiàn)為骨小梁結(jié)構(gòu)變細(xì)，軟骨下骨微骨折，同時(shí)伴有骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞分布增多，脂肪變大，脂質(zhì)沉積等情況［3-4］。

11β-羥基類 固 醇 脫 氫 酶1（（11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1，11β-HSD1）是骨組織中介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素（GC）活性的關(guān)鍵酶，在成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞均有表達(dá)［5］，其氧化與還原效應(yīng)在骨組織中扮演著GC受體前調(diào)節(jié)機(jī)制的重要角色，是組織對(duì)GC應(yīng)用的反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［6］。糖皮質(zhì)激素所引起的骨代謝異常與體內(nèi)尤其是骨組織內(nèi)11β-HSD1的活動(dòng)緊密相關(guān)。成骨細(xì)胞不同的分化階段，細(xì)胞數(shù)量及功能狀態(tài)與骨穩(wěn)態(tài)相關(guān)，受到局部糖皮質(zhì)激素的調(diào)控。目前11β-HSD1與骨代謝異常之間關(guān)系機(jī)制尚待深入研究。

醋酸棉酚（gossypol acetate，GAA）是一種多元酚類化合物，文獻(xiàn)證實(shí)其可以通過糖基化其活性基團(tuán)從而抑制11β-HSD1的功能［3］。本實(shí)驗(yàn)采用GAA作用后觀察不同實(shí)驗(yàn)組股骨頭形態(tài)學(xué)改變、骨組織中11β-HSD1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）／Run相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、CCAAT區(qū)／增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C／EBPα）表達(dá)特點(diǎn)，初步探討11β-HSD1抑制劑對(duì)激素應(yīng)用所致的骨質(zhì)異常的作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 11β-HSD1抗體、PPARγ抗體、Runx2抗體、C／EBPα抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），SP試劑盒（北京中杉生物有限公司），RNA檢測(cè)試劑（大連寶生物公司），引物11β-HSD1、PPARγ、Runx2、C／EBPα的序列（上海生工生物有限公司），GAA（北京中棉有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 模型制作及實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠50只（約200 g，健康2月齡，雌雄不限），分為對(duì)照組，地塞米松（Dex）12周組，Dex＋GAA 12周組，Dex 20周組，Dex＋GAA 20周組，每組10只。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水2 mL；其他組腹腔內(nèi)注射Dex 10 mg／kg，每周2次，共注射12周或20周；Dex＋GAA 12周組，Dex＋GAA 20周組，同時(shí)予GAA 5 mg·kg-1·d-1灌胃；所有大鼠肌注青霉素，20萬U／只，每周1次，預(yù)防感染。

1．2．2 標(biāo)本處理 藥物處理完成，取各組大鼠雙側(cè)股骨頭，一側(cè)置-80℃冰箱中凍存作實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)，另一側(cè)多聚甲醛中固定后，10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣3周，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，作4μm厚連續(xù)切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察評(píng)估。

1．2．3 骨組織切片免疫組織化學(xué)法（SP法） 切片脫蠟、水化后，室溫下3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；高壓下煮沸抗原修 復(fù)，加BSA封 閉 液；滴 加11β-HSD1、C／EBPα、Runx2、PPARγ一抗孵育4℃過夜；加生物素化山羊抗小鼠Ig G，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封片。

所有切片均采用雙盲法作鏡下評(píng)估。HE染色按每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取4張切片，由3名醫(yī)師雙盲下進(jìn)行評(píng)定。4×10倍鏡下觀察計(jì)算股骨頭內(nèi)孔隙數(shù)目，骨小梁輪廓與分布。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)100倍視野，用Imageplus6．0軟件分析計(jì)算100倍鏡下骨小梁面積比值與骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞面積比值。免疫組織化學(xué)切片先選取染色陽性細(xì)胞（成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞），陽性細(xì)胞染色為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒樣染色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞所占其總觀測(cè)細(xì)胞的百分率，得到面積比取平均值。

1．2．4 q RT-PCR法檢測(cè)股骨頭組織的11β-HSD1、PPARγ、Runx2、C／EBPα的表達(dá)

1．2．4．1 股骨頭組織RNA的抽提 凍存股骨頭組織，去除軟骨組織，置入研缽中加入液氮冷凍后，迅速研磨至呈粉末狀。加入RNAiso Plus 1 mL裂解作用5 min后4℃離心。加0．2 mL氯仿，充分搖勻后室溫下靜置5 min，4℃下12 000 r／min離心15 min，取上清液加入等量異丙醇后室溫下靜置10 min，4℃下12 000 r／min離心10 min析出沉淀，向沉淀中加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，4℃下12 000 r／min離心5 min，棄上清液保留沉淀，室溫下干燥10 min，溶解于20μL DEPC水中，取2μL稀釋成100μL后于紫外分光光度計(jì)下測(cè)定mRNA的含量與光密度值（OD）的比值。其余RNA存入-80℃擬行逆轉(zhuǎn)錄處理。

1．2．4．2 RNA逆轉(zhuǎn)錄，q RT-PCR方法檢測(cè)基因表達(dá) 取每組細(xì)胞RNA樣本，根據(jù)上述mRNA的含量計(jì)算1μg mRNA所需的適量RNA體積，加入：5×g DNA Eraser Buffer 2μL，g DNA Eraser 1μL，適量DEPC水構(gòu)成10μL體系，室溫下放置5 min，將上述反應(yīng)液10μL加入：5×Pri me Script Buffer 4 μL，Pri me Script?Enzy me 1μL，RT Pri mer Mix 1μL，DEPC水4μL直至20μL，反應(yīng)條件為：37℃15 min，85℃5 s，4℃下保存。取各組逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，加入SYBR?Premix Ex Taq 10μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，雙蒸水8μL形成20μL反應(yīng)體系，置于PCR平板中，分置2個(gè)復(fù)孔行相關(guān)反應(yīng)。反應(yīng)條件按試劑盒說明操作，置于Light Cycler?480熒光定量PCR系統(tǒng)中測(cè)定。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析或Dunnet分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 應(yīng)用Dex后股骨頭形態(tài)學(xué)改變分析 應(yīng)用Dex后股骨頭松質(zhì)骨小梁顯著減少，骨髓腔隙增加，改變隨應(yīng)用時(shí)間延長(zhǎng)加重；應(yīng)用GAA后骨小梁面積所占比值減少明顯（圖1 A），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），至20周面積比值減少更加明顯（P＜0．01）；骨髓腔隙內(nèi)脂肪細(xì)胞占面積比值則隨Dex應(yīng)用增加，較對(duì)照組均存在顯著性改變，應(yīng)用GAA后面積比例進(jìn)一步增加（P＜0．01），見表1。

表1 各組形態(tài)學(xué)改變分析（±s）

表1 各組形態(tài)學(xué)改變分析（±s）

＊：P＜0．01，▲：P＜0．01，與對(duì)照組比較。

組別 骨小梁面積比值 骨髓腔內(nèi)脂肪占面積比值對(duì)照組59．3±4．4 21．1±2．4 Dex12周組 55．0±3．4＊ 26．7±2．9▲Dex＋GAA 12周組 44．5±3．2＊ 31．6±3．4▲Dex20周組 45．6±3．1＊ 29．1±3．7▲Dex＋GAA 20周組 39．4±4．1＊ 37．1±3．1▲

2．2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)及半定量結(jié)果分析 11β-HSD1主要表達(dá)在成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞的胞漿內(nèi)（圖1B）。脂肪細(xì)胞陽性染色細(xì)胞主要位于骨髓腔內(nèi)，為中小型細(xì)胞型脂肪細(xì)胞；染色陽性成骨細(xì)胞主要位于骨小梁邊緣，呈扁平或柱狀。陽性成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞數(shù)處理組較對(duì)照組隨時(shí)間延長(zhǎng)增多。使用GAA陽性細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間上升（表2）。

C／EBPα陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，成骨與脂肪細(xì)胞中均可見陽性表達(dá)且隨時(shí)間延長(zhǎng)增加，陽性細(xì)胞比例數(shù)升高（圖1C）。PPARγ主要表達(dá)于骨髓脂肪細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主。隨Dex作用時(shí)間延長(zhǎng)，染色陽性脂肪細(xì)胞比例明顯增加；GAA處理12、20周PPARγ表達(dá)增加，染色陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見圖1D和表2。Runx2主要表達(dá)于成骨細(xì)胞核及胞漿中，以胞漿表達(dá)為主。小梁邊緣染色陽性成骨細(xì)胞較對(duì)照組數(shù)量減少，GAA處理12、20周后Runx2表達(dá)陽性細(xì)胞明顯下降，均P＜0．05（圖1E，圖2、3）。

表2 各組基因表達(dá)分析（相對(duì)比較法）

圖1 各組大鼠股骨頭切片HE、11β-HSD1、C／EBPα、PPARγ、Runx2免疫組織化學(xué)染色

圖2 各組不同Dex作用時(shí)間Runx2表達(dá)陽性細(xì)胞比較

圖3 各組不同Dex作用時(shí)間PPARγ染色陽性細(xì)胞比較

2．3 RT-PCR相對(duì)定量方法測(cè)定組織中11β-HSD1、PPARγ、Runx2、C／EBPαmRNA的表達(dá) 與對(duì)照組比較，其余各處理組對(duì)股骨頭組織中11β-HSD1、C／EBPα、PPARγmRNA增加，Runx2減少（P＜0．05）。GAA處理12、20周與相應(yīng)Dex處理組比較，Runx2 mRNA表達(dá)明顯降低，C／EBPα、PPARγmRNA則上升更明顯（P＜0．05）。

3 討 論

糖皮質(zhì)激素誘發(fā)股骨頭壞死的機(jī)制目前尚未完全闡明，存在多種學(xué)說［7］。骨組織局部激素活性水平調(diào)節(jié)異常可能是引起病變的關(guān)鍵因素之一。11β-HSD1是內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，可以催化有生物活性的皮質(zhì)醇與無活性11-脫氫皮質(zhì)酮（以下簡(jiǎn)稱為皮質(zhì)酮）的相互轉(zhuǎn)化［8］；外源性激素作用時(shí)，誘發(fā)局部11β-HSD1表達(dá)與活性改變，對(duì)股骨頭形態(tài)學(xué)與基因表達(dá)變化有何影響，尚未明確［9］。本文研究結(jié)果表明較長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用Dex，SD大鼠股骨頭骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞所占面積比例增高，脂肪體積增大，骨小梁稀疏，小梁占面積比明顯下降，提示長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后該區(qū)骨與脂肪組織分布發(fā)生了改變，局部骨量下降。文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后骨髓脂肪細(xì)胞體積增大，細(xì)胞外脂質(zhì)積聚等表現(xiàn)，最終發(fā)展成為骨壞死改變［3，5，10］。目前缺乏充足的證據(jù)來闡明其中機(jī)制。

本文中局部11β-HSD1表達(dá)增加，提示基于11β-HSD1激素水平的調(diào)節(jié)存在。免疫組織化學(xué)染色表明中小型脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞中11β-HSD1的表達(dá)增加，同時(shí)PPARγ、C／EBPα表達(dá)增加，Runx2減少。Runx2控制成骨細(xì)胞各類特異性基因的表達(dá)（如骨保護(hù)素、骨鈣素等）；PPARγ具有促脂肪分化的能力［11］；C／EBPα主要分布在脂肪代謝旺盛的分化好的細(xì)胞中［8］。股骨頭組織中11β-HSD1表達(dá)存在相對(duì)差異，提示其功能與激素誘發(fā)的病理學(xué)改變存在著一定的關(guān)聯(lián)。Jorgensen等［12］發(fā)現(xiàn)11β-HSD1-／-小鼠有部分骨髓腔內(nèi)脂肪組織的缺失，認(rèn)為11β-HSD1對(duì)激素的增敏反應(yīng)影響了骨髓脂肪細(xì)胞的形成。而To mlinson等發(fā)現(xiàn)11β-HSD1通過激活內(nèi)源性皮質(zhì)酮促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。Sano等［13］也證實(shí)了對(duì)小鼠使用11β-HSD1抑制劑后，可以減少局部脂肪蓄積及脂肪細(xì)胞胰 島 素 的 敏 感 性。本 研 究 也 證 實(shí)11β-HSD1、C／EBPα、PPARγ等主要表達(dá)于骨髓組織中等大小脂肪細(xì)胞，其中激素組骨髓腔脂肪細(xì)胞11β-HSD1陽性指數(shù)升高的同時(shí)可見C／EBPα、PPARγ等表達(dá)增高現(xiàn)象，表明Dex作用下，骨組織11β-HSD1的表達(dá)改變可能通過影響C／EBPα、PPARγ表達(dá)而影響了骨髓組織中中小型脂肪細(xì)胞的分化過程，而在激素誘發(fā)的骨組織病理變化中起到重要的影響作用。

對(duì)于成骨細(xì)胞而言，11β-HSD1對(duì)其的作用與其不同的分化階段有關(guān)。在成骨細(xì)胞分化早期，由于需要糖皮質(zhì)激素的量開始明顯增多，這時(shí)內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的作用是有益于成骨的；至分化晚期后，內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素則是有害于成骨細(xì)胞，使其功能下降［14］。本實(shí)驗(yàn)觀察到用超生理劑量的Dex干預(yù)后，成骨細(xì)胞11β-HSD1的表達(dá)緩慢上升，同時(shí)Runx2的表達(dá)量下降，C／EBPα表達(dá)量微增。在長(zhǎng)期的Dex作用下，Dex與GR結(jié)合后，可以與增加的C／EBPα協(xié)同調(diào)控，共同促進(jìn)成骨細(xì)胞11β-HSD1表達(dá)［15］，增加了激素的激活，使局部活性糖皮質(zhì)激素水平增加，形成正反饋?zhàn)饔?，加重了成骨代謝紊亂。

GAA對(duì)11β-HSD1的活性基團(tuán)進(jìn)行糖基化后起到抑制其活性的作用［3］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨11β-HSD1活性的抑制，股骨頭組織成骨功能受到抑制，成脂性基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為免疫組織化學(xué)分析中Runx2陽性指數(shù)進(jìn)一步下降，PPARγ、C／EBPα陽性指數(shù)則進(jìn)一步上升。此基因表達(dá)的改變?cè)诠撬柚窘M織中尤為顯著。這從另一個(gè)方面說明前述觀察到的脂肪成分所占面積增加的病理改變一致。提示在一定程度上骨質(zhì)減少與成分比例的變化與激素作用后誘導(dǎo)的基因表達(dá)改變相關(guān)。然而，應(yīng)用GAA后，骨質(zhì)局部脂肪組織占優(yōu)勢(shì)的病理改變理論上應(yīng)該得到抑制，但本文卻沒有觀察到這一結(jié)果，可能存在以下原因，人工合成的激素Dex不經(jīng)過11β-HSD1脫氫激活，但誘導(dǎo)其在組織內(nèi)的表達(dá)，也有可能是Dex直接與細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合起作用，而不經(jīng)過11β-HSD1調(diào)節(jié)這一環(huán)節(jié)；再者，受到藥理學(xué)劑量Dex作用后而引起的脂肪組織的積聚或分化增強(qiáng)，還存在其他調(diào)節(jié)通路，單純骨組織局部的調(diào)節(jié)激活不能完全阻斷局部脂肪組織增殖性改變。由于體內(nèi)影響因素眾多，相關(guān)機(jī)制研究有待于進(jìn)一步展開，以闡明主導(dǎo)該病理改變的主要機(jī)制。

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