萬康 綜述 李健 審校

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東青島266100)

冠心病呈現(xiàn)逐步年輕化且發(fā)病率與日俱增的趨勢。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療已成為治療急性冠狀動脈綜合征(acute coronary artery syndrome，ACS)的重要手段，球囊擴張、金屬裸支架或藥物洗脫支架置入都可產(chǎn)生支架內(nèi)再狹窄(ISR)問題，ISR是目前尚未解決的技術(shù)難題。研究發(fā)現(xiàn):組織因子(TF)與冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)病密切相關(guān)，TF水平升高與斑塊破裂、經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)成形術(shù)再狹窄、微血管再生呈正相關(guān)，應用TF途徑抑制物[1]及其人工合成的TF抑制劑[2]均能降低TF活性，并能減輕內(nèi)膜增生及抑制支架內(nèi)血栓形成。從基因調(diào)節(jié)水平來解決ISR，可能成為真正解決ISR的方法。因此減少TF生成可有效防治冠狀動脈ISR的發(fā)生。本文將對TF小干擾RNA(TF-siRNA)的調(diào)控機制、目前的研究進展及其臨床應用等問題做一綜述。

1 TF-siRNA的概述

1.1 TF及RNA干擾技術(shù)

TF即凝血因子Ⅲ，既可作為受體與其配體Ⅶa結(jié)合后啟動外源性凝血途徑，又可激活凝血因子Ⅺ啟動內(nèi)源性凝血途徑，促進凝血酶原激活物的生成[3]，并能通過正向反饋機制加速血液的凝固。

近年研究發(fā)現(xiàn)，某些小的雙鏈RNA通過促使mRNA降解，高效、特異性阻斷機體特定基因表達，這種基因沉默技術(shù)被稱作RNA干擾(RNAi)，其中21～25 nt的siRNA在細胞內(nèi)直接觸發(fā)RNAi，同時，不會造成非特異的基因表達抑制。反之，過多的siRNA會導致非特異的RNA降解。RNAi通路主要通過形成并激活RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)發(fā)揮作用，可通過兩種通路共同導致翻譯抑制[4]。

1.2 TF的化學結(jié)構(gòu)及分布

TF即CD142，是分子量為47 kD(≈4.7×104)的單鏈跨膜糖蛋白，屬于細胞因子超家族成員。TF含263個氨基酸:胞外區(qū)(219個氨基酸，可與FⅦ結(jié)合)、單一跨膜區(qū)(23個氨基酸)、胞漿區(qū)(21個氨基酸)。其基因定位于染色體1p21-1p22。

在生理情況下，細胞不表達生理活性的TF，血液循環(huán)中TF的水平極低，其在血管壁中的水平遠高于血液循環(huán)。在病理情況下，如組織損傷、吸煙、高脂血癥、糖尿病及心血管疾病等均可促使血管內(nèi)皮細胞(VEC)、血管平滑肌細胞(VSMC)、血小板和動脈粥樣斑塊中TF高表達。TF也廣泛存在于心肌細胞中[5]。在臨床研究方面也證實，ACS合并高TIMI評分(＞4分)的患者血漿中產(chǎn)生的TF水平遠高于TIMI評分(＜3分)的患者[6]，并且TF增加程度可預測患者心血管事件的發(fā)生。然而，對于TF的來源，仍有不少爭議，如實驗中培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞刺激后可表達TF，而體內(nèi)通過內(nèi)皮細胞表達的TF的證據(jù)非常有限[7]。

1.3 TF-siRNA的功能及生物學作用

TF作為唯一以跨膜蛋白形式表達的凝血因子，胞內(nèi)段參與信號轉(zhuǎn)導功能[8];胞外段除參與凝血反應外，還在動脈粥樣硬化、血管生成及血管重塑等方面發(fā)揮重要作用。此外，TF可調(diào)控VEC、平滑肌細胞(SMC)的信號轉(zhuǎn)導，誘導其遷移、增殖和分泌細胞外基質(zhì)，促進內(nèi)膜增生。總之，TF的生物學功能主要是通過依賴于信號傳導和凝血活化這兩個途徑實現(xiàn)。應用TF-siRNA可明顯抑制血管的形成，延緩穩(wěn)定性斑塊向不穩(wěn)定性斑塊進展的速度，減輕內(nèi)膜增生，抑制支架內(nèi)血栓形成;防治ISR的發(fā)生。既往利用反義RNA、抗TF抗體、重組TF途徑抑制物[9]等抑制TF表達作用效果不太理想，而下調(diào)TF表達的RNAi技術(shù)是一種新興的基因失活技術(shù)，具有不易降解、高度特異性、高效性、長期性等優(yōu)點。目前對RNAi技術(shù)的研究已深入到基因表達調(diào)控、基因功能和基因治療[10]等層面，利用RNAi技術(shù)沉默TF表達方法是當前研究的熱點。

2 TF-siRNA遞送載體研究的新進展

siRNA作為新型的基因治療藥物，其在體內(nèi)有效發(fā)揮作用的關(guān)鍵，在于它能否高效地被遞送至靶細胞并與靶基因結(jié)合，靶向遞送siRNA是藥物進入臨床應用最主要的環(huán)節(jié)。良好的轉(zhuǎn)染載體能有效保護siRNA到達靶細胞，發(fā)揮基因沉默效應。目前研究的問題主要集中在:siRNA導入機體的途徑是否經(jīng)過化學修飾[11]、表面電荷、載體的大小及給藥載體的選擇等方面。載體的大小是一個重要的參數(shù)，既要避免腎臟清除作用，又要保證其能順利進入靶器官，應確保納米粒子大于10 nm，而不超過150 nm。來自多數(shù)的文獻報道認為，20～50 nm范圍內(nèi)的微粒比更大或更小的顆粒吸收更迅速?！袄硐氲摹陛d體應該達到上述標準，因而，不同的遞送載體被研究及應用于臨床。它們可以被分為兩大部分:病毒類和非病毒類[12]遞送載體。TF-siRNA遞送載體同樣需要具備上述條件，以下為TF-siRNA遞送載體的簡介。

2.1 siRNA病毒遞送載體

病毒載體是最早被應用的siRNA體內(nèi)遞送方式，實驗研究中主要是利用它來提供DNA質(zhì)粒或前體分子誘導RNAi技術(shù)。較高的轉(zhuǎn)導效率，是它們的一個有利特性。病毒載體作為基因傳遞的工具被廣泛地采納，但它存在致突變或癌變的潛能，對宿主免疫原性及生產(chǎn)成本高等問題，大大限制了它們的應用。針對這些缺點，研究人員也試圖通過對病毒載體的改進來克服它們在臨床應用中的弊端。如在重組腺病毒制備和擴增過程中，構(gòu)建TF-siRNA的重組缺陷型腺病毒載體，可避免產(chǎn)生免疫原性的野生型病毒，在實驗中顯示較低免疫原性的特點，已經(jīng)運用于評估基因治療的一些臨床試驗。然而，運載藥物進入臨床之前毒性問題仍待解決[13]。

2.2 SiRNA非病毒遞送載體

非病毒載體遞送效率較低，但具有安全性高且易合成等特性，更適合于臨床疾病的治療，近幾年來對非病毒類給藥載體的研究越來越受到關(guān)注。殼聚糖(chitosan，CS)、脂質(zhì)體、去端肽膠原是目前最常用的轉(zhuǎn)染TF-siRNA的非病毒類載體遞送系統(tǒng)。

2.2.1 CS TF-siRNA 復合物

CS作為一種安全有效的非病毒載體，具有低毒性、低免疫源性、良好的生物相容性等優(yōu)點。研究表明，CS納米粒作為siRNA遞送載體穩(wěn)定性好，可通過人體最小毛細血管，穿透組織間隙及被細胞攝取，并能逃避被降解，延長siRNA作用時間。細胞吸收CS納米粒復合物及隨后從吞噬系統(tǒng)釋放是轉(zhuǎn)染過程中兩個重要的限速步驟。已有研究表明，CS納米粒比其他微粒有更高的細胞吸收率，而采用包封型CS-TPPTF-siRNA納米粒在轉(zhuǎn)染效率和基因沉默效應等方面比吸附型CS-TPP-TF-siRNA納米粒效果更高[14]。CS納米粒作為運送載體具有美好的應用前景。

2.2.2 脂質(zhì)體TF-siRNA復合物

陽離子脂質(zhì)體可通過靜電作用與帶負電荷siRNA相互作用，形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體siRNA復合物。脂質(zhì)體復合物表面電荷是細胞攝取納米粒子最重要的給藥參數(shù)。帶正電荷的脂質(zhì)體復合物首先沉積并黏附于細胞表面，然后通過胞吞作用穿過帶負電荷的細胞膜脂質(zhì)雙分子層，通過動力蛋白定向運送到核周區(qū)，并迅速聚集在核周區(qū)，最后，siRNA從脂質(zhì)體復合物中釋放出來發(fā)揮作用。脂質(zhì)體具有與細胞膜類似的成分，都是由磷脂和膽固醇構(gòu)成;因此，具有脂質(zhì)生物相容性，這是脂質(zhì)體遞送載體最大的優(yōu)勢。陽離子脂質(zhì)體是一種很有前途的非病毒傳遞系統(tǒng)，并且已被廣泛運用于TF-siRNA遞送載體的實驗研究，但也有報道，脂質(zhì)體siRNA如不借助于轉(zhuǎn)染試劑，不能保證高效的細胞攝取和基因沉默[15]效應，并且陽離子脂質(zhì)體具有細胞膜活性，可能對細胞產(chǎn)生一定的破壞作用等問題，限制了它在體內(nèi)的應用。

2.2.3 去端肽膠原TF-siRNA

去端肽膠原是一種經(jīng)蛋白酶處理后得到的高純度Ⅰ型膠原。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用去端肽膠原攜帶TF-siRNA[16]可穩(wěn)定而緩慢釋放siRNA，具有不需復雜的轉(zhuǎn)染步驟等優(yōu)點。

由于遞送載體存在對機體免疫系統(tǒng)的不良反應，因此，既要減少對機體免疫系統(tǒng)的影響，又要保持siRNA對特異性靶基因的沉默作用，將成為今后研究的重要方向。

3 ISR的機制

支架置入術(shù)后造成管腔機械性損傷和血管內(nèi)膜剝脫，露出膠原蛋白和TF，激活凝血級聯(lián)反應，這可能會導致急性或亞急性支架內(nèi)血栓形成，然而，在血管損傷處也可能會導致新生內(nèi)膜增生，產(chǎn)生ISR。完全再內(nèi)皮化可有效抑制新生內(nèi)膜的增殖，可能從根本上解決ISR。ISR的機制包括:(1)VEC的損傷與增生;(2)VSMC的過度增殖與遷移[17];(3)血栓形成，細胞外基質(zhì)的作用;(4)炎癥反應;(5)血管彈性回縮及重塑。其中，VSMC的過度增殖與遷移可能在ISR中起著比較重要的作用。所有再狹窄過程均是基因治療潛在的靶點，目前的研究主要是針對VSMC或VEC，使其表達特定基因或干擾某些基因的表達，發(fā)揮抑制ISR的作用。

4 TF-siRNA對VEC及SMC的影響

生理情況下，VEC釋放的舒-縮血管因子處于動態(tài)平衡，VEC通過它所產(chǎn)生的血管舒縮因子實現(xiàn)對血管張力的調(diào)節(jié)，VEC處于易損的功能性界面，支架術(shù)后導致其功能障礙，主要是血管舒張功能受損。內(nèi)皮損傷及功能失調(diào)是再狹窄發(fā)生的啟動因素，損傷周邊內(nèi)皮細胞增殖、遷移修復可實現(xiàn)內(nèi)膜的再內(nèi)皮化。當支架置入術(shù)后，同時也會造成內(nèi)皮細胞對SMC的接觸抑制功能喪失，血管中膜的SMC可在血液中多種因子的刺激下，由非增殖性的收縮表型向增殖性的合成表型轉(zhuǎn)化，由中層向內(nèi)膜遷移，部分細胞增殖，最終，導致血管新生內(nèi)膜形成，合成表型SMC的增生和遷移在ISR的發(fā)生進程中起著關(guān)鍵的作用[18]。VEC通過抑制循環(huán)生長因子和分泌SMC增殖的抑制因子，防止SMC的增殖[19]。因此，有完整的VEC的覆蓋，可抑制SMC的過度增生及血栓形成，從而減輕細胞增殖引起的ISR，血管內(nèi)皮快速修復是預防ISR發(fā)生的關(guān)鍵。研究表明，在動脈球囊損傷模型中，動脈中層平滑肌受損后，TF mRNA表達迅速上調(diào);支架植入術(shù)后也可刺激人冠狀動脈內(nèi)皮細胞中TF的表達水平，同時伴隨著TF蛋白水平的上調(diào)，但未上調(diào) TF途徑抑制劑[20];藥物洗脫支架置入后本身可增加患者體內(nèi)TF活性，促進動脈血栓形成[21]。外周血TF升高程度與介入局部SMC增生程度正相關(guān)，可能作為預測介入術(shù)后再狹窄的一項檢測指標[22]。通過上調(diào)TF表達可縮短豬內(nèi)皮細胞凝血時間，siRNA介導的TF表達抑制將延長凝血時間，也可延緩血管閉塞的時間[23]。通過TF-siRNA可明顯抑制VSMC的增生，加速支架術(shù)后血管的再內(nèi)皮化，減少ISR的發(fā)生。

5 TF-siRNA對新生血管生成的影響

TF及其信號通路在調(diào)解人血管生成中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。實驗表明，TF在人微血管內(nèi)皮細胞(HMVECs)和人微血管平滑肌細胞(HMVSMCs)中，HMVECs充當血管形成的調(diào)解器，HMVSMCs也發(fā)揮了重要作用，TF被證明在協(xié)調(diào)微血管形成方面起到了關(guān)鍵的作用。然而，TF沉默在VEC和SMC具有抑制管樣結(jié)構(gòu)形成的作用。研究也表明，沉默內(nèi)皮細胞的TF抑制管樣結(jié)構(gòu)形成的作用比沉默在SMC的效果更加明顯[24]。TF可誘導的VEC中的趨化因子配體-2(CCL2)釋放，誘導相關(guān)的新生血管形成，其主要是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子-1CE26 transformation specific-1，Ets-1介導的基因轉(zhuǎn)錄，Ets-1活化調(diào)節(jié) CCL2表達，招募SMC向內(nèi)皮細胞遷移，促進新的微血管的成熟。因此，TF/Ets-1/CCL2軸在微血管生成和穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著重要的功能[25]。在內(nèi)皮細胞中，TF形成一個復雜的信號機制誘導微血管的形成[26]，TF-siRNA可明顯抑制微血管的生成。有研究表明，TF對血管生成的效應獨立于血管內(nèi)皮生長因子[27]。目前的研究已明確，斑塊內(nèi)血管新生是促進穩(wěn)定性斑塊向不穩(wěn)定性斑塊發(fā)展的重要機制，但尚無明確報道關(guān)于新生血管和臨床上發(fā)生支架術(shù)后再狹窄之間的關(guān)系。

6 TF-siRNA與支架內(nèi)血栓形成和ISR的應用前景

TF既是凝血始動因子，又直接促進內(nèi)膜增生，并且貫穿血栓形成到血管重塑全過程。既往研究認為，血小板聚集增強是支架術(shù)后引發(fā)血栓形成的主要原因，但近年來大量研究結(jié)果表明，TF在支架術(shù)后血栓形成過程中可能起到更為關(guān)鍵的作用。而Morange等[28]研究認為，ACS患者血漿TF水平增高是評估心血管死亡風險的獨立指標，他的研究同時也顯示了TF途徑抑制物水平與心肌損傷程度間存在一定關(guān)聯(lián)。另有研究表明，TF途徑抑制物除了與其抑制VSMC的遷移、抑制局部血栓形成、減少新生內(nèi)膜增厚和減輕血管重塑外，還與其抑制VSMC的增殖及促進其凋亡[29]有關(guān)，也可防治 ISR 發(fā)生。Bis等[30]在一項研究中，報道了來自ACS患者的血漿中檢測到了納摩爾濃度的TF。由于TF病理性高度表達是凝血系統(tǒng)強烈且持久的激活因素，因此不但導致患者血栓形成的風險增加，血栓栓子體積增大，臨床后果也更為嚴重[31]。由于在血栓形成和ISR過程中的關(guān)鍵角色，從基因水平抑制或阻斷TF表達能有效減少TF生成，可產(chǎn)生與TF途徑抑制物相似的效果。TF靶向治療已開始成為研究支架術(shù)后血栓形成及再狹窄的重點對象。

7 TF-siRNA的臨床應用前景

藥物洗脫支架已大大減少早期的ISR的發(fā)病率，但局部的抗增殖治療可能會干擾血管愈合及內(nèi)皮化不全。TF siRNA能明顯地抑制SMC的增殖，促進內(nèi)皮細胞的生長，達到快速支架內(nèi)膜再內(nèi)皮化，這種基因治療對于ISR具有美好的應用前景。有望從根本上解決ISR的發(fā)生，目前越來越多的臨床試驗正在評估RNAi療法是否適合人類疾病的治療[32]。未來的RNAi療法有可能很大程度上依賴于RNA的設(shè)計及給藥技術(shù)的改進，可通過提高藥物療效并減少脫靶效應而達到持續(xù)、高效、安全的效果。

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