張少言 林赟霄 陳浩 綜述 王佑華 審校

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032)

冠心病是當(dāng)代威脅中老年健康的疾病之一，是造成中老年人死亡的重要原因。隨著冠狀動脈支架等冠狀動脈再通術(shù)的開展，嚴(yán)重心肌梗死患者的缺血心肌受到很大的益處，但是其術(shù)后再狹窄率較高。近些年來，由于藥物涂層支架及新型抗凝藥物的廣泛應(yīng)用，冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄率已顯著降低，但國外一些大規(guī)模的臨床試驗(yàn)表明，藥物涂層支架仍存在5%左右的再狹窄率[1]。另外，其對于晚期心肌梗死患者的病死率作用較小(BRAVE-2和TOSCA-2研究);對于穩(wěn)定型心絞痛患者與藥物治療比較沒有優(yōu)勢(COURAGE研究)。因此，促進(jìn)心肌缺血區(qū)域的側(cè)支循環(huán)形成和血管新生在當(dāng)前冠心病的治療策略中顯得尤為重要。至此，治療性血管新生成為了治療冠心病的另一個新靶點(diǎn)。

1 血管新生及其影響因素的實(shí)驗(yàn)研究

廣義的血管新生涉及血管發(fā)生、血管新生以及動脈生成這三個主要的過程。血管發(fā)生是指胚胎發(fā)育過程中血管從無到有的過程，主要是指內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)從骨髓遷移的過程;血管新生是指在原有的毛細(xì)血管基礎(chǔ)上通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，從先前存在的血管處以芽生或非芽生的形式生成新的毛細(xì)血管的過程;動脈生成是指在已經(jīng)生成的小動脈基礎(chǔ)上形成管徑更大的側(cè)支循環(huán)。

影響血管新生的有關(guān)因素綜述如下。

1.1 促血管新生因子

1.1.1 血管內(nèi)皮生長因子

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族主要包括胎盤生長因子(PIGF)、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及血小板源性生長因子，能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞并刺激它增殖。

Freitas-Andrade等[2]探討了 PIGF 在缺氧時引起的腦血管生成方面的潛在作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PIGF+/+的動物7 d后血管生成有了40%的顯著增長。

VEGF-A主要是通過結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)-1和VEGFR-2來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和促血管新生的。VEGFR-1對血管生成主要起著負(fù)性作用，而VEGFR-2對促血管生成的信號表現(xiàn)出強(qiáng)大的酪氨酸激酶活性。Kendrew等[3]用VEGFR-2抗體阻斷VEGFR-2信號通路后，血管新生數(shù)目也顯著減少了。VEGFR-1的基因不僅編碼全長型mRNA受體，而且還編碼一種短的可溶性mRNA受體(sFlt-1)，而可溶性sFlt-1具有內(nèi)源性VEGF抑制劑的功能[4]。

Bry等[5]發(fā)現(xiàn)，VEGF-B不能誘導(dǎo)顯著的毛細(xì)血管生成，對通透性的增加和聚集炎癥細(xì)胞到缺血組織也沒有益處?？梢?，VEGF-B似乎有一個相對有限的血管生成活性。

VEGF-C與其受體VEGFR-3結(jié)合后，能直接誘導(dǎo)血管芽生和腫瘤血管生成[6]。

VEGF-D是一種分泌型糖蛋白，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，它能誘導(dǎo)膽囊癌血管生成[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-E在促進(jìn)血管生成的治療中可能比VEGF-A更有用，角蛋白14-VEGF-A的轉(zhuǎn)基因小鼠在增加血管生成的同時表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥和水腫[8]。

1.1.2 成纖維細(xì)胞生長因子

成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族由22個相關(guān)多肽組成，其中如FGF1和FGF2，具有強(qiáng)效的血管生成活性。最近，F(xiàn)rontini等[9]利用基因芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在血管成熟過程中，F(xiàn)GF9在血管平滑肌細(xì)胞被高度上調(diào)。其作用是促進(jìn)血管肌化，但不是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖或血管新生。

1.1.3 低氧誘導(dǎo)因子

當(dāng)心肌缺血缺氧時，低氧誘導(dǎo)因子(HIF)1-α被激活。在有氧條件下，HIF1-α被脯氨酰羥化蛋白酶和HIF抑制因子羥化后失活。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脯氨酰羥化蛋白酶和HIF抑制因子基因雙敲落的小鼠，HIF1-α表達(dá)被上調(diào)，增加了EPC的動員和促進(jìn)了血管新生[10]。HIF-2α是HIF-1α的同源體，也能直接激活基因表達(dá)來編碼一些促血管生成因子，如VEGF和血管生成素[11]。Skuli等[12]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 和 HIF-2α 在促血管新生中具有互補(bǔ)的作用。在內(nèi)皮細(xì)胞HIF-2α缺陷的小鼠，結(jié)果也觀察到了血管形成，但是這些血管不能經(jīng)歷正常的動脈生成，導(dǎo)致了組織區(qū)域低灌注。所以，HIF-2α也是血管新生必不可少的一個組織因子。HIF-3α4是HIF-3α的剪接變體，研究發(fā)現(xiàn)，它能夠與HIF-1α形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，阻止HIF-1α與低氧反應(yīng)元件的結(jié)合，導(dǎo)致VEGF的轉(zhuǎn)錄水平顯著受到抑制，顯示出一種負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制[13]。

1.1.4 胰島素樣生長因子-1

胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是一種與胰島素結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽類激素，在EPC培養(yǎng)基中，IGF-1通過抗細(xì)胞凋亡和促血管新生效應(yīng)介導(dǎo)強(qiáng)有力的心肌修復(fù)作用，而IGF-1的中和抗體組對心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)和功能的改善卻沒有影響[14]。

1.1.5 轉(zhuǎn)錄生長因子-β

轉(zhuǎn)錄生長因子-β(TGF-β)超家族主要包括33個成員，如TGF-βs、骨形成蛋白和activins等。有關(guān)小鼠和人類的遺傳研究揭示，TGF-β通路在血管發(fā)育和維持血管穩(wěn)態(tài)中扮演著舉足輕重的作用。缺乏TGF-β信號元件的小鼠由于血管缺陷，在胚胎期就死亡了;TGF-β受體突變的患者，血管發(fā)育異常，易患遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、肺動脈高壓等[15]。TGF-β1和VEGF都能誘導(dǎo)血管新生，但對血管內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)卻是相反的。VEGF保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，而TGF-β1誘導(dǎo)其凋亡[16]。

1.2 祖/干細(xì)胞

1.2.1 EPC

Rufaihah等[17]將 CD133+EPC移植到心肌梗死大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠的成熟血管密度增加了將近3倍，心肌梗死面積也顯著減少了。但是，EPC的作用機(jī)制和“身份”識別仍舊是懸而未決的[18]。因?yàn)镋PC表面抗原不同，其對血管新生的作用也不盡相同。

1.2.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)能分化成各種心血管細(xì)胞，在一個體外后肢缺血模型中，iPS分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞后促進(jìn)了血管新生[19]。但是，這里仍然存在一些問題[20]，如iPS隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的致畸性;iPS分化成有功能的心肌細(xì)胞仍然是相對緩慢，效率低下的。

1.2.3 其他

其他的EPC還有脂肪組織干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、骨髓源性的祖細(xì)胞(BMC)等。

1.3 小分子RNA

小分子RNA(miRNA)是一些短段的(20～25個核苷酸)非編碼RNA，通過結(jié)合靶信使mRNA，能夠調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，導(dǎo)致翻譯抑制或降解。研究發(fā)現(xiàn)，不同的miRNA對血管生成效應(yīng)的影響不同。如miR-424(322)[21]等的上調(diào)，miR-126(115)[22]等的下調(diào)都具有血管生成效應(yīng)。

1.4 內(nèi)皮型一氧化氮合酶

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶被激活后釋放一氧化氮，可以調(diào)控平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)EPC的遷移和存活，介導(dǎo)血管新生[23]。

1.5 炎癥細(xì)胞及因子

一些炎癥細(xì)胞主要包括單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，也能作用于血管新生。在小鼠，單核細(xì)胞主要包括兩種亞型:Ly6Chi和Ly6Clo。心肌缺血發(fā)生后，它們先后滲透到缺血區(qū)域。Ly6Chi主要在心肌損害早期，具有吞噬、蛋白水解和炎癥的功能;Ly6Clo則發(fā)生在晚期，具有減輕炎癥反應(yīng)和表達(dá)VEGF的作用。Nahrendorf等[24]認(rèn)為，Ly6Clo通過分泌 VEGF來促進(jìn)血管生成，而且兩種亞基的任何一種匱乏都會阻礙心肌梗死后新生血管的形成。相反，Cochain等[25]認(rèn)為是Ly6Chi，而不是Ly6Clo，促進(jìn)后肢缺血模型的血管新生。因此，單核細(xì)胞亞基促血管新生的作用還需進(jìn)一步的研究和澄清。

在體外角膜模型，中性粒細(xì)胞的耗竭顯著性減少了炎癥性血管新生[26]。

另外，一些炎癥分子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1，腫瘤壞死因子-α，白介素-1β和白介素-8也能夠促進(jìn)血管新生[27]。

2 冠心病治療性血管新生的臨床研究

結(jié)合血管新生的影響因素，治療性血管新生主要分為蛋白生長因子治療、基因治療、細(xì)胞治療和miRNA。

2.1 蛋白生長因子治療

使用生長因子類蛋白的治療是治療性血管新生的第一種探索。兩種最常用的生長因子是VEGF和FGF。但是，它們并沒有產(chǎn)生強(qiáng)大的治療效果，而且存在劑量依賴性，可能的解釋是蛋白質(zhì)的生物半衰期過短。

2.2 基因治療

基因治療是指將生長因子基因轉(zhuǎn)移到心肌組織，進(jìn)而通過誘導(dǎo)生長因子的產(chǎn)生來促進(jìn)血管的生長。用于治療性血管新生的基因往往與蛋白治療中使用的生長因子都是相同的。但是，基因治療能保持一個長期的療效。其中的一個瓶頸是關(guān)于基因載體的問題。目前使用的載體有質(zhì)粒、脂質(zhì)體和病毒載體。而質(zhì)粒的低轉(zhuǎn)導(dǎo)率，脂質(zhì)體的免疫原性和炎性，逆轉(zhuǎn)錄病毒通常只轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，而心肌細(xì)胞通常不是一個有較高速度的有絲分裂細(xì)胞，都存在很大的局限性。腺病毒恰好避免了上述問題，目前被大家所接受。但是，臨床上有關(guān)基因治療效果的報道卻是不一致的。Kalil等[28]在13例頑固性心絞痛患者的心肌內(nèi)注射phVEGF165，數(shù)據(jù)表明患者的癥狀和心肌灌注得到了改善。而NORTHERN試驗(yàn)[29]納入了93例3級或4級心絞痛癥狀的患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 000 μg的VEGF165基因治療組和安慰劑組在心肌灌注的3個月或6個月后并沒有差異。

2.3 細(xì)胞治療

細(xì)胞治療主要是充分挖掘干細(xì)胞的修復(fù)和再生能力。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是不僅可以更換損壞的心肌細(xì)胞，而且也分泌一些因子促進(jìn)原來的心肌細(xì)胞改善它們的功能。最近關(guān)于干細(xì)胞移植的臨床試驗(yàn)進(jìn)展很快，主要包括BMC和MSC，但結(jié)果也不盡如人意。Assmus等[30]研究發(fā)現(xiàn)，2年后BMC組的累積終點(diǎn)死亡事件、心肌梗死的再發(fā)率和血運(yùn)重建率都顯著低于安慰劑組，BMC治療對心肌梗死后心功能恢復(fù)可能至少持續(xù)2年。而最新一項(xiàng)關(guān)于BMC的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，ST段抬高性心肌梗死患者經(jīng)成功的再灌注治療后，冠狀動脈內(nèi)無論是早期還是晚期(5～7 d或3～4周)注入BMC在隨后的4個月內(nèi)對左室功能的改善都沒有意義[31]。關(guān)于MSC的移植，臨床報道也不一致。Jazi等[32]臨床試驗(yàn)證明MSC的移植能改善心肌梗死后心功能，增加左室射血分?jǐn)?shù)。而另一項(xiàng)關(guān)于ST段抬高性心肌梗死后MSC注入的臨床隨機(jī)試驗(yàn)卻表明，MSC組與控制組的左室射血分?jǐn)?shù)在6個月、12個月和24個月后并沒有發(fā)現(xiàn)任何的差異[33]。

2.4 miRNA

雖然體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)不少miRNA表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)能夠促進(jìn)血管新生，但是目前還沒有通過臨床試驗(yàn)研究miRNA的治療性血管新生作用。

鑒于上述單個治療方法效果不佳，聯(lián)合治療策略在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已得到開展。一項(xiàng)Td/FGF1-EPC實(shí)驗(yàn)[34]，即把FGF1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)給體外培養(yǎng)的 EPC，證實(shí)了兩者的聯(lián)合使用對血管新生具有更強(qiáng)大的促進(jìn)能力。Foubert等[35]評估了EPC和平滑肌祖細(xì)胞的聯(lián)合治療，結(jié)果顯示毛細(xì)血管和小動脈密度在聯(lián)合治療組的提高優(yōu)于單獨(dú)使用。所以，聯(lián)合治療策略在一定程度上增加了血管新生的概率，其在臨床上的治療效果，也需要我們進(jìn)一步地探討。

3 結(jié)語

目前，在心絞痛或心肌梗死的臨床試驗(yàn)中，治療性血管新生的療效報道尚不盡一致、是相互矛盾的。但隨著實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步地探討和完善，臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，miRNA的興起和聯(lián)合治療策略的開展，其在冠心病的治療中仍然是一個很有前途的戰(zhàn)略，將為不適合現(xiàn)有療法的冠心病患者提供新的策略。

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