鮑宏剛，張衛(wèi)澤，李濤，陳永清，馬凌，賈俊杰，徐志勇

丙氨酰谷氨酰胺對心肌缺血模型大鼠心肌纖維化及縫隙連接蛋白43重構(gòu)的影響及其機制

鮑宏剛，張衛(wèi)澤，李濤，陳永清，馬凌，賈俊杰，徐志勇

目的：研究丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gln）誘導熱休克蛋白70（HSP70）高表達對心肌缺血模型大鼠心肌纖維化及縫隙連接蛋白43（Cx43）重構(gòu)的影響及其機制。

丙氨酰谷氨酰胺;心肌纖維化;縫隙連接蛋白43;細胞外信號調(diào)節(jié)激酶;熱休克蛋白70

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1024.)

心肌缺血后心室重塑是慢性心力衰竭的重要環(huán)節(jié)，而心肌纖維化和縫隙連接蛋白43（Cx43）重構(gòu)是心室重塑的重要表現(xiàn)形式，心肌纖維化和Cx43重構(gòu)不僅影響心肌收縮和舒張功能，而且易致心律失常的發(fā)生，使猝死的發(fā)生率增加[1-8]。有研究指出細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路的激活可參與心肌缺血后心室重塑即心肌纖維化和Cx重構(gòu)[9-11]，此外尚有研究[12]指出通過熱應(yīng)激誘導心肌組織表達熱休克蛋白70（HSP70）可影響細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路中磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白的表達，在一定程度上抑制該通路的激活。但誘導HSP70表達升高是否可通過抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路的激活而改善心肌纖維化程度及Cx43重構(gòu)，相關(guān)報道少見。近期研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺可以誘導HSP70的表達[13]，故本研究選擇丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gln）作為谷氨酰胺的供體誘導HSP70表達，采用參考文獻[14]方法皮下多點注射大劑量鹽酸異丙腎上腺素（ISO）建立大鼠心肌缺血模型， 觀察Ala-Gln誘導HSP70高表達對大鼠心肌纖維化和Cx43重構(gòu)的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

實驗材料：實驗起止時間2013-04至2013-05。實驗動物：SPF級雄性SD大鼠（購自甘肅省中醫(yī)學院實驗動物中心）32只，平均體重 （200±20）g。 注射用丙氨酰谷氨酰胺（海南靈康制藥有限公司），二甲基亞砜（DMSO，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），槲皮素（美國Sigma公司），鹽酸異丙腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司），兔抗鼠connexin 43抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗鼠HSP70抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗鼠p-ERK1/2抗體（武漢博士德生物工程有限公司），羊抗兔生物素標記性二抗（武漢博士德生物工程有限公司），DAB染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

實驗分組及動物模型的建立：32只SPF級雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法隨機等分為4組：對照組、ISO[5mg/（kg.d）]組（模型組）、ISO[5mg/（kg.d）]+Ala-Gln [0.75mg/（kg.d）]組（干預組）、ISO[5mg/（kg.d）]+槲 皮 素 [100 mg/（kg.d）] +Ala-Gln [0.75 mg/（kg.d）]+DMSO組（槲皮素組）。模型組、干預組、槲皮素組大鼠按5 mg/kg體質(zhì)量腹部皮下多點注射ISO，1次/d，連續(xù)7天；干預組于ISO注射前60 min按0.75 mg/kg體質(zhì)量給予Ala-Gln溶液（Ala-Gln+0.9%Nacl配成濃度為3.3%的溶液）腹腔注射1次/d，連續(xù)4周；槲皮素組在給予Ala-Gln溶液前6小時，按100 mg/kg體質(zhì)量給予槲皮素（一種熱休克蛋白抑制劑）腹腔注射，使用時溶解于DMSO中，1次/d，連續(xù)4周。對照組大鼠分別在相應(yīng)時間內(nèi)皮下注射生理鹽水至第7天、腹腔注射與模型組、干預組、槲皮素組等量的生理鹽水至第4周。大鼠心肌缺血模型的鑒定采用伊紅素（HE）染色法，而且經(jīng)過預實驗鑒定結(jié)果證實此種造模方法可取，32只SD大鼠均完成整個實驗過程。 取材及標本保存： 各組大鼠按上述方案實施至第4周時處死。取部分心肌組織置于中性甲醛液中固定24小時，經(jīng)石蠟包埋后，連續(xù)切片5張，每張厚3 μm，2張用伊紅素染色和馬森（Masson）染色，其余3張用免疫組化法觀察心肌組織中HSP70、p-ERK1/2及Cx43表達及分布。

大鼠心肌組織病理改變及膠原容積分數(shù)（CVF）計算 ： 心肌石蠟組織切片常規(guī)伊紅素染色，光鏡400倍下觀察心肌肌纖維化及心肌細胞排列情況并攝片，Masson染色后每張切片選取4個不重疊無血管視野（×400）拍照，運用Image-Pro plus 5.0圖像掃描軟件進行圖像分析，計算心肌CVF。CVF（%）=膠原面積/全視野面積×100%。

免疫組化法觀察大鼠心肌組織中HSP70、p-ERK1/2及Cx43的表達及分布：將心肌組織切片置于68℃烤箱中烤60 min后行免疫組化染色，光鏡下觀察染色及HSP70、p-ERK1/2及Cx43分布情況，每張切片中各取4個非重疊無血管視野（×400），利用Image-Proplus 5.0圖像掃描軟件進行圖像分析，測定每個視野下陽性物質(zhì)的平均光密度值=累積光密度值/面積。

統(tǒng)計學方法：采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以表示，單因素方差分析用于組間比較，LSD法用于兩兩比較，并采用Pearson相關(guān)性檢驗進行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

各組大鼠心肌組織伊紅素染色結(jié)果：圖中心肌組織的細胞核被染成藍色， 細胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細胞均呈紅色。對照組與干預組心肌纖維清晰，排列規(guī)則，無明顯纖維化；而模型組、槲皮素組肌纖維排列紊亂、細胞外間隙增寬，部分心肌纖維扭曲腫脹、肌漿溶解、纖維斷裂，纖維化程度明顯。圖1

各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果：圖中綠色部分代表心肌間質(zhì)膠原成分，細胞質(zhì)、心肌纖維和紅細胞被染成深淺不一的紅色，細胞核則被染成藍色。心肌CVF干預組 [（9.235±1.302）%]與對照組[（8.140±0.970）%]比較，心肌纖維化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干預組與槲皮素組[（27.361±8.536）%] 、模型組[（29.352±8.726）%]比較， 心肌纖維化均減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜ 0.01）。圖2

圖1 各組大鼠心肌組織伊紅素染色結(jié)果（×400）

圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果（×400）

各組大鼠心肌細胞中HSP70的分布及含量：正常心肌細胞的HSP70分布于心肌細胞胞漿中，免疫組化染色陽性呈棕黃色。免疫組化染色結(jié)果干預組大鼠心肌細胞HSP70的含量（0.321±0.047）較對照組（0.162±0.021）、模型組（0.167±0.013）、槲皮素組（0.169±0.024）均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（圖3中HSP70 -3A、3B、3C、3D）

大鼠心肌細胞中p-ERK1/2的分布及含量：正常心肌細胞的和p-ERK1/2分布于心肌細胞胞漿中，免疫組化染色陽性呈棕黃色。大鼠心肌細胞中p-ERK1/2的含量，干預組與對照組比較[（0.195±0.022）vs （0.181±0.041） ]，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干預組較模型組 （0.387±0.088）、槲皮素組（0.350 ±0.067）均降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而模型組、槲皮素組中其含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.01）。（圖3中p-ERK1/2 -3A、3B、3C、3D）

大鼠心肌細胞中Cx43的分布及含量：正常心肌細胞的Cx43線性規(guī)律分布于心肌細胞閏盤處，免疫組化染色陽性呈棕黃色。大鼠心肌細胞中Cx43的含量，干預組與對照組比較[（0.258±0.072）vs（0.301±0.082） ]，差異無統(tǒng)計學意義（ P＞ 0.05），且呈線性分布于心肌細胞閏盤處僅少量分布于心肌細胞側(cè)面；干預組較模型組（0.147±0.021）、槲皮素組（0.162±0.028）組均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），分布無規(guī)律且側(cè)面分布相對增加；模型組與槲皮素組大鼠心肌細胞中Cx43的表達量無明顯差異（P＞0.05）。（圖3中 Cx43 -3A、3B、3C、3D）

圖3 各組大鼠心肌細胞中HSP70、p-ERK1/2、Cx43免疫組化染色結(jié)果（×400）

p-ERK1/2的含量與心肌纖維化程度、Cx43含量的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果：p-ERK1/2的含量與心肌纖維化程度呈正相關(guān)（r=0.978， P＜0.01）；而p-ERK1/2與Cx43含量含量呈負相關(guān)（R=-0.795， P＜0.01）。

3 討論

心肌梗死后心室重塑是慢性心力衰竭的重要環(huán)節(jié)，而心肌纖維化和Cx43重構(gòu)是心室重塑的重要表現(xiàn)形式。心肌纖維化可導致心臟舒張、收縮功能障礙，還可導致心肌心律失常發(fā)生[1-3]。Cx43表達量減少、非均勻化及側(cè)面化被認為是Cx43重構(gòu)的表現(xiàn)形式。Cx43表達量的減少和非均勻化可改變電傳導的同向性，使電傳導速率降低，且易形成折返，造成心律失常，而其側(cè)面化，可引起延遲后去極化[15,16]，病理條件下心肌Cx43的這些重塑，是構(gòu)成心律失常的基礎(chǔ)之一。

本實驗中大鼠大劑量皮下注射ISO 7d后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組出現(xiàn)明顯的心肌纖維化，Cx43表達量減少、且出現(xiàn)非均勻化及側(cè)面化，與李玉光等[17]、林吉進等[18]研究結(jié)果相符。而且模型組p-ERK1/2的表達也較對照組增加，表明注射ISO后， 細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路激活并參與大鼠心肌纖維化和Cx43重構(gòu)，該研究結(jié)果與Sugden等[9]、張衛(wèi)澤等[10]、Ruch等[11]研究結(jié)果相一致。干預組給予Ala-Gln腹腔注射后發(fā)現(xiàn)心肌組織表達HSP70顯著高于其他各組，且與模型組相比較心肌纖維化程度和Cx43重構(gòu)均減輕，而p-ERK1/2的表達卻減少，提示谷氨酰胺對心肌缺血模型大鼠的心肌纖維化和Cx43重構(gòu)具有保護作用且與抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)槲皮素組使用了HSP70抑制劑后抑制了心肌組織中HSP70的表達，同時p-ERK1/2的表達水平升高，心肌纖維化程度和Cx43重構(gòu)與模型組比較無明顯差別，表明Ala-Gln對心肌缺血模型大鼠心肌纖維化和Cx重構(gòu)的保護作用主要是通過誘導心肌組織HSP70表達、抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路來實現(xiàn)的，使用抑制劑抑制了HSP70的表達，該保護作用也消失。

綜上所述，Ala-Gln可通過誘導心肌組織中HSP70的表達而起到改善心肌缺血大鼠心肌纖維化和Cx43重構(gòu)的作用，其機制可能與下調(diào)p-ERK1/2的表達，抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路的激活有關(guān)。Ala-Gln已廣泛應(yīng)用于臨床，具有肯定的安全性和有效性，故Ala-Gln誘導HSP70升高，用于防治心肌缺血患者心肌纖維化和Cx43的重構(gòu)具有潛在臨床價值。

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Effects of Ala-Gln on Myocardial Fibrosis and Connexin43 Remodeling in Experimental Rats’ Model

BAO Hong-gang, ZHANG Wei-ze, LI Tao, CHEN Yong-qing, MA Ling, JIA Jun-jie, XU Zhi-yong.
Department of Cardiology, The 322 Hospital of PLA, Datong (037000), Shanxi, China

ZHANG Wei-ze, Email: zhangzwz@medmail.com.cn

Objective: To investigate the effects of Ala-Gln induced heat shock protein 70 (HSP70) expression on myocardial fi brosis and connexin43 (Cx43) remodeling in experimental rats’ model.Methods: A total of 32 SPF male SD rats were randomly divided into 4 groups: ①Control group, ②Model group, the rats received isoprenaline (ISO) 5m/(kg.d), ③Intervention group, the rats received ISO + Ala-Gln 0.75mg/(kg.d), ④Quercetin group, the rats received ISO + quercetin 100mg/(kg.d) + Ala-Gln + DMSO. n=8 in each group. All animals were treated for 7 days and killed in 4 weeks for relevant examinations. HE and Masson staining was conducted to observe myocardial fi brosis, then calculate collagen volume fraction; immunohistochemistry was applied to measure myocardial HSP70 expression,extracellular signal regulated kinase (p-ERK1/2) and Cx43 distribution, then conduct semi-quantitative analysis by specif i c soft ware.Results: HE and Masson staining indicated that Control group had no obvious myocardial fi brosis, Model group and Quercetin group had obvious fi brosis, and Intervention group showed less fi brosis than the other 2 groups, all P＜0.01. The fibrosis level was similar between Intervention group and Control group, P＞0.05. The myocardial HSP70 expression was similar among Control, Model and Quercetin groups, P＞0.05, while HSP70 expression was signif i cantly higher in Intervention group than the other 3 groups, all P＜0.01. The myocardial p-ERK1/2 level was lower in Intervention group than Model and Quercetin groups, all P＜0.01. The myocardial Cx43 level was similar between Control group and Intervention group with linear distribution, while it was higher in Intervention group than Model and Quercetin groups with disordered distribution, all P＜0.01.Conclusion: Ala-Gln inducing the higher expression of HSP70, which may reduce myocardial fi brosis in experimental rats, it could be because of HSP70 down regulating p-ERK1/2 expression and inhibiting ERK signaling pathway.

Ala-Gln; Myocardial fi brosis; Connexin43; Extracellular signal-regulated kinase; Heat shock protein 70

2014-03-12）

（編輯：曹洪紅）

037000 山西省大同市，中國人民解放軍第322醫(yī)院 心血管內(nèi)科（鮑宏剛、賈俊杰、徐志勇）；蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 心血管內(nèi)科（張衛(wèi)澤、李濤、陳永清、馬凌）

鮑宏剛 主治醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病及心臟電生理研究 Email: baohonggang@163.com 通訊作者：張衛(wèi)澤 Email: zhangzwz@medmail.com.cn

R541

A

1000-3614（2014）12-1024-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014. 12.016

方法：32只SPF級雄性SD大鼠（200±20）g，按隨機數(shù)字表法隨機等分為4組：對照組、鹽酸異丙腎上腺素（ISO）[5mg/（kg.d）]組（模型組）、ISO[5mg/（kg.d）]+Ala-Gln [0.75mg/（kg.d）]組（干預組）、ISO[5mg/（kg.d）]+槲皮素 [100mg/（kg.d）] +Ala-Gln [0.75mg/（kg.d）]+二甲基亞礬（DMSO）組（槲皮素組）。每組每天1次給予相應(yīng)試劑， ISO 連續(xù)給藥7d后停止，余處理繼續(xù)至第4周時處死大鼠。伊紅素（HE）、Masson染色法觀察心肌纖維化情況并計算膠原容積分數(shù)；免疫組織化學法觀察心肌組織中HSP70、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）及Cx43分布，并通過軟件進行半定量分析。

結(jié)果：伊紅素、Masson染色結(jié)果顯示對照組無明顯心肌纖維化，模型組和槲皮素組出現(xiàn)明顯的纖維化，而干預組較模型組和槲皮素組心肌纖維化程度均減弱（P均＜0.01），干預組與對照組的心肌纖維化程度無明顯差異（P＞0.05）。對照組、模型組、槲皮素組中HSP70的含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而干預組中HSP70的含量較上述各組明顯升高,且差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。心肌組織中p-ERK1/2的含量干預組較模型組、槲皮素組均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。Cx43含量在對照組與干預組中差異無統(tǒng)計學意義且呈線性規(guī)律分布，干預組較模型組和槲皮素組均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），分布無規(guī)律性，且側(cè)面分布相對增多。

結(jié)論：Ala-Gln誘導HSP70高表達可減輕ISO誘發(fā)的心肌缺血模型大鼠心肌纖維化程度和Cx43的重構(gòu)，其機制可能與HSP70下調(diào)p-ERK1/2的表達，抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路激活有關(guān)。